日本血吸蟲性別差異蛋白質(zhì)組及抱雌溝蛋白基因功能研究.pdf

1、本論文針對此特點開展了日本血吸蟲性別差異蛋白質(zhì)組和雄蟲特異性表達的抱雌溝蛋白基因的功能研究，以探索血吸蟲雌雄蟲合抱、發(fā)育成熟的分子機理，開拓免疫預(yù)防新途徑。 一、關(guān)于日本血吸蟲性別差異蛋白質(zhì)組研究。本研究利用蛋白質(zhì)組學技術(shù)首次對日本血吸蟲蟲卵、童蟲(14天)、成熟雌蟲和成熟雄蟲的可溶性蛋白、疏水性蛋白和膜蛋白進行了系統(tǒng)分離，構(gòu)建了各自的高分辨率雙向電泳圖譜。表明蟲卵、童蟲、成熟雌蟲和成熟雄蟲在可溶性蛋白組份分別分離到1016±6

2、7，1808±89，1142±45和1288±32個蛋白斑點；在疏水性蛋白組份分別分離到1425±108，952±59，847±75和965±69個蛋白斑點；在膜蛋白組份分別分離到78±3、67±3、108±4和122±4個蛋白斑點。比較分析獲得合抱后雌雄成蟲特異呈現(xiàn)的性別差異蛋白質(zhì)譜，雌雄成蟲分別獨特呈現(xiàn)23±2和41±4個可溶性蛋白斑點；26±3和¨±1個疏水性蛋白斑點；4和5個膜蛋白斑點。鑒定了28個合抱后雌雄成蟲特異呈現(xiàn)的蛋白。

3、結(jié)果提示參與細胞間信息傳遞的信號分子、參與基因轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯調(diào)控分子和參與代謝酶類、發(fā)育調(diào)節(jié)因子等在合抱后雌雄蟲呈現(xiàn)表達差異。本研究為深入揭示雌雄蟲合抱后蟲體的發(fā)育、雌蟲成熟產(chǎn)卵的機制提供了分子基礎(chǔ)，對開發(fā)新的疫苗候選抗原和藥物靶標具有重要價值。 二、關(guān)于日本血吸蟲抱雌溝蛋白基因的功能研究。抱雌溝蛋白為血吸蟲雄蟲特異性表達，在與其合抱的雌蟲體表廣泛分布一種性別特異性蛋白。本論文利用RNA干擾技術(shù)對抱雌溝蛋白基因的功能進行了研究。

4、根據(jù)日本血吸蟲抱雌溝蛋白基因序列設(shè)計3對dsRNA分子(s1，s2，s3)并分別按低和高濃度(50nM和200nM)加入培養(yǎng)體系以干擾抱雌溝蛋白基因的表達。利用RT-PCR、Westernblotting和免疫熒光分析證明能顯著抑制抱雌溝蛋白基因的轉(zhuǎn)錄，可高達84％。又分析了dsRNA分子干擾的劑量效應(yīng)，結(jié)果表明dsRNA分子(s1)抑制抱雌溝蛋白基因具有劑量依賴性，當dsRNA分子終濃度為100nM作用7天時，抱雌溝蛋白基因的轉(zhuǎn)錄水平

5、降低75％。對蟲體雌雄蟲合抱效應(yīng)的觀察表明，干擾后雌雄合抱受到不同程度的影響，其中兩個高濃度干擾組(s1，s2)的合抱現(xiàn)象完全受到抑制。利用掃描電子顯微鏡分析合抱完全受到抑制的雄蟲抱雌溝表膜結(jié)構(gòu)，與對照組相比其結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)瘠的間斷，瘠間隙大和刺短的變化。進一步利用cDNA微陣列對干擾抱雌溝蛋白基因后引起的蟲體相關(guān)基因表達變化進行了初步探索，結(jié)果顯示參與信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子功能的基因呈現(xiàn)表達下調(diào)，參與膜轉(zhuǎn)運、能量和離子代謝及應(yīng)激蛋白等基因呈

6、現(xiàn)表達上調(diào)。通過上述研究發(fā)現(xiàn)抱雌溝蛋白基因具有影響血吸蟲雌雄蟲合抱功能，本論文結(jié)果也是國內(nèi)外首次明確某種物質(zhì)能影響雌雄蟲的合抱，對于開拓抗血吸蟲生殖發(fā)育新途徑的理論基礎(chǔ)和實踐應(yīng)用具有重要意義。采用尾靜脈動態(tài)注射技術(shù)將dsRNA分子導入到血吸蟲感染的小鼠體內(nèi)。結(jié)果表明在動物體內(nèi)血吸蟲抱雌溝蛋白基因的轉(zhuǎn)錄和表達明顯降低，雌雄蟲的合抱受到顯著抑制。據(jù)作者查詢所知，這是在動物個體水平上實現(xiàn)利用RNAi技術(shù)成功干擾血吸蟲基因功能的首例，揭示了基因