日本血吸蟲致弱尾蚴差異表達蛋白的篩選與鑒定.pdf

1、血吸蟲病(schistosomiasis)是由血吸蟲(schistosome)感染引起的一種嚴重危害人類健康的人獸共患寄生蟲病，主要流行于亞洲、非洲、拉丁美洲的76個國家和地區(qū)。我國主要流行日本血吸蟲病，至今已有2100年歷史。據(jù)2006年全國疫情調(diào)查資料顯示，我國大部分流行地區(qū)已消滅或控制了血吸蟲病，但尚有105個血吸蟲病流行縣(市、區(qū))，約67萬感染者，且近年來疫情有所回升，并伴隨出現(xiàn)向城市蔓延的趨勢，因此。血吸蟲病防治仍然是我國重

2、要的公共衛(wèi)生問題之一。 目前國內(nèi)外防治血吸蟲病的主要措施是采取人畜同步化療、易感地帶滅螺等相結(jié)合的綜合性防治方法，但由于現(xiàn)有的以吡喹酮為主要藥物的化療不能有效防治治療后再感染，且存在低敏感蟲株及潛在藥物耐藥性的威脅，使得血吸蟲病的有效防治受到阻礙。上世紀80年代，研究者們確立了以發(fā)展血吸蟲病疫苗作為防治血吸蟲病的研究重點，使藥物化療的短效作用與疫苗接種的長效免疫預防作用相結(jié)合，不僅能有效減少疾病的總體發(fā)病率，也能避免單純化療后的

3、重復感染。 抗血吸蟲病疫苗的研究歷經(jīng)了死疫苗、減毒活疫苗、基因工程蛋白疫苗及核酸疫苗幾個階段，目前主要集中在特異性重組蛋白疫苗及核酸疫苗方向，通過模擬宿主自然感染后產(chǎn)生的保護性機理，以具有保護能力的抗血清或單抗篩選蟲體cDNA文庫來尋找特異的保護性相關(guān)抗原。然而，近30年來的實驗研究已證明，這種單純以刺激Th1或Th2型體液免疫應答為主的特異性抗原分子疫苗并不能穩(wěn)定地誘導動物模型高效的保護性免疫力。致弱尾蚴疫苗的研究始于上世紀6

4、0年代末。大量實驗證明，經(jīng)輻照致弱的侵襲性曼氏血吸蟲或日本血吸蟲尾蚴能穩(wěn)定誘導實驗動物產(chǎn)生高達90％的保護性免疫力，是目前公認的最高效、穩(wěn)定的抗血吸蟲病疫苗。對曼氏血吸蟲致弱尾蚴疫苗的進一步研究發(fā)現(xiàn)，這種保護性免疫力主要是由獲得性免疫機制介導的，由Th1型優(yōu)勢細胞免疫應答向Th2型優(yōu)勢體液免疫應答發(fā)展的持續(xù)性免疫應答過程。致弱尾蚴在入侵皮膚處刺激天然免疫系統(tǒng)細胞的應答，釋放或分泌的大量蟲體抗原可直接促進天然免疫細胞分泌產(chǎn)生Th1型細胞因

5、子及趨化因子，或者被遞呈給皮膚引流淋巴結(jié)，刺激Th1表型T細胞大量增殖活化而激發(fā)獲得性免疫應答。雖然后續(xù)Th2型優(yōu)勢體液免疫應答的誘導機制不是很清楚，但其與高效的保護性免疫力水平是直接相關(guān)的。 輻照致弱尾蚴疫苗已被證實是目前疫苗研究開發(fā)的最理想模擬模型，而目前對其研究主要集中在免疫宿主的免疫效應分子機制方面，有關(guān)保護性特異抗原分子的尋找也局限在使用保護性血清進行免疫沉淀、Western blot及篩選蟲體cDNA文庫等方法。由于

6、輻照射線具有較高能量，可能破壞或損傷蟲體DNA結(jié)構(gòu)而影響mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯，最終引起相關(guān)蛋白質(zhì)表達水平或結(jié)構(gòu)的變化。這些差異表達的蛋白質(zhì)可能與正常非照射尾蚴分泌或脫落的蛋白有所不同，可能是致弱尾蚴誘導高水平保護性免疫力的分子基礎(chǔ)。因此，對致弱尾蚴蟲體總蛋白質(zhì)水平變化的認識能為深入探索高效的保護性免疫機制及疫苗的研究提供扎實的實驗依據(jù)。 研究目的： 本研究旨在對紫外線輻照致弱日本血吸蟲尾蚴的可溶性蟲體總蛋白質(zhì)表達譜及差異

7、表達蛋白進行分析與鑒定，擬為揭示致弱尾蚴誘導產(chǎn)生高水平保護性免疫力的效應機制的可能分子基礎(chǔ)提供在蟲體蛋白質(zhì)水平上的全面認識，另一方面也為模擬這一機制以研制抗血吸蟲病疫苗提供新的思路和有效的疫苗候選分子。 研究方法： 研究方法主要包括采用雙向電泳技術(shù)對紫外線輻照致弱尾蚴(UVAC)及正常尾蚴(NC)的可溶性蟲體總蛋白質(zhì)譜進行比較與分析，對差異表達蛋白進行MALDI—TOF—MS質(zhì)譜鑒定，并采用實時熒光定量PCR對其中4個表

8、達上調(diào)的差異表達蛋白在mRNA轉(zhuǎn)錄水平上的變化及與紫外線輻照劑量及作用時間的效應關(guān)系進行探討。此外，對這4個表達上調(diào)的蛋白進行基因克隆及重組蛋白的原核表達與鑒定，并采用ELISA、Western blot及淋巴細胞增殖試驗等對重組蛋白的抗原性、免疫原性及免疫細胞刺激效應等功能進行檢測。 研究結(jié)果： 1.正常尾蚴與紫外線輻照致弱尾蚴可溶性蟲體總蛋白的雙向電泳分離經(jīng)雙向電泳(pH3-10，20 cm×24 cm×0.1 cm

9、)的分離及銀染，獲得NC及UVAC可溶性蟲體總蛋白質(zhì)圖譜，分別于圖譜上獲得1458±29及1379±45個蛋白斑點，絕大部分蛋白點分布于分子量20kDa～97kDa、等電點4～8之間。 2.紫外線輻照致弱尾蚴可溶性差異表達蛋白的鑒定 比較NC與UVAC兩組樣本圖譜間斑點相對體積的差異，選取差異比值大于1.5的71個斑點作為差異表達蛋白候選斑點。15個蛋白斑點在UVAC組表達上調(diào)，其中有5個為在UVAC組中特異性表達；56

10、個蛋白斑點在UVAC組表達下調(diào)，其中有8個在UVAC組中未見表達。使用MALDI—TOF—MS成功鑒定出其中20個斑點，4個在UVAC組中表達上調(diào)，其中1個為在UVAC組中特異性表達；16個在UVAC組中表達下調(diào)，其中2個在UVAC組中未見表達。據(jù)功能可將這些差異表達蛋白大致分為5類，分別為：細胞骨架與結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白、能量代謝相關(guān)蛋白、轉(zhuǎn)錄/翻譯與信號轉(zhuǎn)導/調(diào)控相關(guān)蛋白、熱休克家族相關(guān)蛋白及其他功能蛋白如20S蛋白酶體等。 3.差

11、異表達蛋白mRNA轉(zhuǎn)錄水平與紫外線輻照劑量及作用時間的效應關(guān)系 采用實時熒光定量PCR對4個表達上調(diào)差異表達蛋白SjActin、SjADH、SjHSP70、Sjβ—Tubulin的編碼基因在mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化進行定量分析，并對這種變化與紫外線輻照劑量及作用時間的關(guān)系進行探討。結(jié)果顯示在300μW/cm2及400μW/cm2較高UV劑量處理下4個基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平均表現(xiàn)為上調(diào)，而在100μW/cm2及200μW/cm2低U

12、V劑量處理下轉(zhuǎn)錄水平變化不明顯。輻照后1d即可出現(xiàn)基因轉(zhuǎn)錄水平的改變，而隨培養(yǎng)時間的延長，轉(zhuǎn)錄水平的變化呈現(xiàn)恢復的趨勢。 4.差異表達蛋白全長編碼基因的擴增、克隆及表達 根據(jù)NCBI GenBank中日本血吸蟲SjActin、SjADH、SjHSP70、Sjβ—Tubulin基因序列，設計特異性引物從尾蚴cDNA噬菌體文庫中擴增各基因的全長編碼序列，并定向克隆入原核表達質(zhì)粒pET28a(+)或pET30a(+)中，經(jīng)PC

13、R、雙酶切及測序鑒定克隆成功。將成功構(gòu)建的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)進行重組融合蛋白原核表達，經(jīng)His—tag親和層析柱純化獲得高純度的重組融合表達蛋白(rSjActin、rSjADH、rSjHSP70、rSjβ—Tubulin)，并經(jīng)質(zhì)譜鑒定證實。 5.差異表達重組蛋白的免疫學功能研究 將純化后rSjActin、rSjADH、rSjHSP70、rSjβ—Tubulin分別免疫Balb/c小鼠，獲得高效價

14、特異性免疫血清。ELISA及Western blot檢測顯示這4種重組蛋白均具有良好的免疫原性及免疫反應性。小鼠致敏脾淋巴細胞增殖試驗顯示4個重組融合蛋白對UVAC免疫小鼠脾淋巴細胞的增殖均具有一定的刺激作用。 討論與小結(jié)： 本研究應用蛋白質(zhì)組學技術(shù)，對紫外線輻照致弱日本血吸蟲尾蚴差異表達的可溶性蟲體蛋白進行分析與鑒定，發(fā)現(xiàn)輻照后蟲體總蛋白表達量下降，且一些細胞骨架與結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白、能量代謝相關(guān)蛋白、轉(zhuǎn)錄/翻譯與信號轉(zhuǎn)導/

15、調(diào)控相關(guān)蛋白、熱休克家族相關(guān)蛋白及其他功能蛋白如20S蛋白酶體等5類功能蛋白分子表達發(fā)生變化；此外還發(fā)現(xiàn)這種變化在高劑量輻照處理后1d即發(fā)生，并隨著培養(yǎng)時間的延長而呈現(xiàn)恢復趨勢，表明輻照對蟲體的影響具有一定的時效性。其中表達上調(diào)的4個蛋白分子經(jīng)克隆、表達獲得的重組融合蛋白具有良好的免疫原性及免疫反應性，并對紫外線輻照致弱尾蚴免疫小鼠脾淋巴細胞增殖具有一定的刺激作用。 本研究在國際上首次應用蛋白質(zhì)組學技術(shù)對紫外線輻照致弱尾蚴的蟲體