當(dāng)歸多糖的結(jié)構(gòu)與抗腫瘤作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：當(dāng)歸多糖是傳統(tǒng)中藥當(dāng)歸Angelicasinensis(Oliv.)Diels的主要藥用成分之一。隨著中藥多糖增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、抗腫瘤、抗輻射作用的發(fā)現(xiàn)，近年來，當(dāng)歸多糖也引起了愈來愈多的關(guān)注。前期的研究表明：當(dāng)歸總多糖對(duì)實(shí)體性腫瘤S-180無明顯的抑制作用；但低分子量的當(dāng)歸多糖組分對(duì)S-180實(shí)體瘤的抑瘤率卻可達(dá)36％。此結(jié)果提示：當(dāng)歸多糖的抗腫瘤作用與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。由于當(dāng)歸多糖的結(jié)構(gòu)目前尚未闡明，故本研究通過對(duì)當(dāng)歸均一性多糖

2、的結(jié)構(gòu)測定、抗腫瘤作用的比較和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡機(jī)理的探討，為闡明當(dāng)歸多糖抗腫瘤作用的構(gòu)效關(guān)系和作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為挖掘潛在的抗腫瘤當(dāng)歸多糖提供試驗(yàn)依據(jù)。 方法：(1)用尺寸排阻色譜和離子交換色譜對(duì)當(dāng)歸總多糖進(jìn)行分離純化，得到6種均一性當(dāng)歸多糖。用苯酚-硫酸法、考馬斯亮藍(lán)法、咔唑法、HPSEC、旋光度測定、UV等分析方法對(duì)6種多糖的總糖、蛋白、糖醛酸含量，均一性及分子量，旋光度等理化指標(biāo)進(jìn)行了測定。(2)采用化學(xué)方法，包括：多糖全

3、水解、甲基化分析、部分酸水解、碳化二亞胺糖醛酸還原及儀器分析方法，包括：GC、GC-MS、IR、NMR(1H，13C，1H/1H-COSY,HSQC，HMBC，TOCSY和NOESY)等對(duì)當(dāng)歸多糖APS-3aⅠ、APS-3aⅡ和APS-3aⅢ的完整一級(jí)結(jié)構(gòu)和酸性多糖APS-1b、APS-3b和APS-3c的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行測定。(3)MTT法測定6種當(dāng)歸多糖及總多糖對(duì)5種體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞增殖的影響。采用小鼠肉瘤S-180移植模型，對(duì)6種當(dāng)

4、歸多糖體內(nèi)抑瘤率進(jìn)行測定；通過檢測脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、外周血白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等指標(biāo)觀察6種多糖對(duì)免疫系統(tǒng)的影響。(4)通過Hochest33342熒光染色法觀察凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變；用AnnexinV/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率；流式細(xì)胞儀PI單染色法檢測細(xì)胞周期變化；用蛋白印跡法檢測Cytc的釋放及caspase-3的活化；免疫組織化學(xué)法檢測Bcl-2和Bax在HeLa細(xì)胞的表達(dá)。 結(jié)果：(1)所得的6種當(dāng)歸多糖APS

5、-1b，APS-3aⅠ，APS-3aⅡ，APS-3aⅢ，APS-3b和APS-3c的HPSEC譜中呈現(xiàn)單一對(duì)稱峰，表明其均為均一性多糖。6種多糖的理化性質(zhì)有一定的差異。(2)當(dāng)歸多糖APS-3aⅠ的分子量為1.7×105Da，組成的單糖僅為(1→6)-α-D-Glcp；APS-3aⅡ的分子量為3.9×104Da，組成的單糖為(1→4)-α-D-Glcp和(1→6)-α-D-Glcp，摩爾比為4.0∶1.0；APS-3aⅢ的分子量為5.1

6、×103Da，單糖的組成為(1→4)-α-D-Glcp、(1→6)-α-D-Glcp、(1→4,1→6)-α-D-Glcp、β-Araf-(1→和α-D-Glcp-(1→，摩爾比為7.2∶5.0∶1.0∶1.1∶1.1；APS-3aⅢ部分酸水解后透析袋外的部分由Glc-Ara(5.1∶0.9)構(gòu)成，非透析部分由α-D-Glcp-(1→和(1→4)-α-D-Glcp以1.0∶9.4的比例構(gòu)成。在3種多糖的NMR譜中均出現(xiàn)了以上糖殘基的特征

7、信號(hào)，IR譜中出現(xiàn)了α-Glcp的特征吸收峰。APS-1b的分子量為7.4×105Da，單糖組成為Glc-Gal-Ara-Rha-GalA(1.0∶7.5∶38.2∶2.6∶4.9)；APS-3b的分子量為1.1×105Da，單糖組成為Glc-Gal-Ara-Rha-GalA(1.0∶7.2∶8.3∶1.1∶2.9)；APS-3c的分子量為1.4×104Da，單糖組成為Glc-Gal-Ara-Rha-Man-Xyl-GalA(6.3∶4

8、.7∶6.7∶6.5∶1.6∶1.0∶13.2)；APS-3b的部分GalA殘基上連有-OCH3。(3)6種當(dāng)歸多糖對(duì)體外培養(yǎng)的5種人腫瘤細(xì)胞增殖的影響具有很大差異；其中APS-3aⅢ的作用比較突出，有明顯的抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用，且這種作用具有明顯的時(shí)效與量效關(guān)系。6種當(dāng)歸多糖對(duì)荷瘤小鼠S-180的抑瘤率也具有一定差異，其中APS-3aⅡ、APS-3aⅢ和APS-3c具有明顯的抑瘤作用，且呈劑量依賴關(guān)系；在100mg/kg的劑量下，A

9、PS-3aⅢ對(duì)S-180的抑制率可達(dá)51.07％；6種當(dāng)歸多糖對(duì)荷瘤小鼠免疫器官指數(shù)的影響各不相同，其中APS-3aⅢ的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)高于對(duì)照組；APS-3aⅢ可增加外周血白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的數(shù)量，且具有明顯的劑量依賴關(guān)系。(4)當(dāng)歸多糖APS-3aⅢ作用于HeLa細(xì)胞后，可見明顯的凋亡細(xì)胞和凋亡峰，S期的細(xì)胞比例增高，凋亡率隨著藥物濃度的增加而加大，300mg/l時(shí)的凋亡率可達(dá)9.1±1.6％(P＜0.01)；隨著APS-3aⅢ濃度

10、的增加，細(xì)胞漿中Cytc的表達(dá)和細(xì)胞中caspase-3蛋白的表達(dá)逐漸升高；30mg/的APS-3aⅢ作用細(xì)胞48h后，Bcl-2蛋白陽性表達(dá)減少，同時(shí)Bax蛋白陽性表達(dá)升高。 結(jié)論：(1)當(dāng)歸多糖APS-3aⅠ是由(1→6)-α-D-Glcp線性連接而成的葡聚糖；APS-3aⅡ是由(1→4)-α-D-Glcp和(1→6)-α-D-Glcp以4∶1的摩爾比連接而成的葡聚糖；APS-3aⅢ的主鏈由→4)-α-D-Glcp-(1→構(gòu)

11、成，分支點(diǎn)位于其O-6位，β-Araf-(1→和(1→6)-α-D-Glcp位于支鏈，主鏈的末端為α-D-Glcp-(1→；組成多糖APS-1b、APS-3b和APS-3c的單糖殘基中含有大量的GalA，并且APS-3b的部分GalA殘基上連有-OCH3。(2)6種當(dāng)歸多糖具有不同的體內(nèi)外抗腫瘤作用：APS-1b、APS-3aⅡ、APS-3aⅢ、APS-3b和APS-3c體內(nèi)外均呈現(xiàn)一定程度的抗腫瘤作用；APS-3aⅠ無抗腫瘤作用。AP

12、S-3aⅢ的體內(nèi)外抗腫瘤作用均較強(qiáng)。(3)當(dāng)歸多糖的抗腫瘤作用與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，阿拉伯葡聚糖APS-3aⅢ是一個(gè)極具潛力的抗腫瘤活性成分。(4)APS-3aⅢ能促進(jìn)荷瘤小鼠的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)，外周血白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量的增加，表明當(dāng)歸多糖調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能可能是其抗腫瘤作用的機(jī)理之一。(5)APS-3aⅢ可阻滯細(xì)胞于S期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，此作用可能是通過影響B(tài)cl-2和Bax的表達(dá)，刺激線粒體釋放Cytc，活化caspase-3產(chǎn)生的。