靈芝多糖抗腫瘤作用的免疫分子機(jī)制研究.pdf

1、靈芝多糖GLB系從靈芝[Ganodermalucidum(LeyssexFr.Karst.)]子實(shí)體中提取的多糖組份，易溶于水。大量文獻(xiàn)報(bào)道靈芝多糖具有免疫調(diào)節(jié)作用和抗腫瘤作用，多數(shù)研究報(bào)道認(rèn)為靈芝多糖在體外沒有直接的抑制或殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，然而體內(nèi)給藥卻具有良好的抗腫瘤作用，因此，一般認(rèn)為靈芝多糖的抗腫瘤作用是通過增強(qiáng)免疫功能而介導(dǎo)的。雖然有許多學(xué)者從免疫學(xué)的角度研究了靈芝多糖的抗腫瘤機(jī)制，而且取得了較好的進(jìn)展，但其確切機(jī)制仍然不是

2、十分清楚，有待深入研究。 目的：本研究選用荷瘤小鼠及其細(xì)胞作為研究材料，嘗試從Toll樣受體4(TLR4)及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的角度、從拮抗前列腺素E2(PGE2)免疫抑制的角度探討靈芝多糖的免疫學(xué)抗腫瘤機(jī)制。 方法：MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖程度；ELISA方法檢測(cè)腫瘤壞死因子α(TNF-α)、γ-干擾素(IFN-γ)的含量；半定量RT-PCR方法檢測(cè)白細(xì)胞介素1α(IL-1α)、白細(xì)胞介素2(IL-2)、TNF-α、IFN-γ

3、mRNA的表達(dá)水平。 結(jié)果：靈芝多糖GLB在50-400μg·ml-1的濃度范圍內(nèi)可促進(jìn)荷瘤小鼠脾細(xì)胞的增殖反應(yīng)。選擇GLB的亞適促增殖濃度200μg·ml-1為刺激模型，特異性大鼠抗小鼠TLR4單克隆抗體可對(duì)抗GLB的促增殖作用，在濃度為2.0μgml-1時(shí)可完全取消GLB的促增殖作用(P=0.000)。 GLB在濃度為50-200μg·ml-1的范圍內(nèi)可促進(jìn)荷瘤小鼠脾細(xì)胞TNF-α的產(chǎn)生，加入抗TLR4抗體(1和2μ

4、g·ml-1)后，GLB的促進(jìn)作用逐漸減弱(P=0.005，P=0.001)，但不能完全取消GLB對(duì)TNF-α的促分泌作用。 GLB(200μg·ml-1)能促進(jìn)荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α，抗TLR4抗體(1和2μg·ml-1)對(duì)這一促進(jìn)作用也有顯著的對(duì)抗作用(P=0.007，P=0.003)，但不能完全阻斷；然而，p38MAPK特異性阻斷劑SB203580(20μM)和NF-κB特異性阻斷劑helenalin(10μM

5、)，可以完全取消GLB促進(jìn)荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌TNF-α的作用(P=0.000)。 GLB增加荷瘤小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ的含量，加入抗TLR4抗體(2.0μg·ml-1)之后，其促分泌作用受到明顯的抑制(P=0.000)，但不能完全取消。通過腹腔給藥，GLB劑量為100和200mg·kg-1體重時(shí)，可使荷瘤小鼠血清IFN-γ的水平分別提高97.4和126.8％(P=0.000)。 在混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)(ML

6、R)中，固定PGE2的濃度為20μM，在其中再加入不同濃度的GLB，培養(yǎng)48小時(shí)后，當(dāng)GLB為100和200μg·ml-1時(shí)可部分對(duì)抗PGE2(20μM)的抑制作用(P=0.044，P=0.008)。 培養(yǎng)4小時(shí)后，GLB(200μg·ml-1)促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞IFN-γmRNA的表達(dá)，而PGE2(20μM)呈明顯的抑制作用。當(dāng)GLB為100和200μg·ml-1時(shí)可部分對(duì)抗PGE2(20μM)的抑制作用(P=0.030，P=0.

7、000)。 培養(yǎng)8小時(shí)后，GLB(200μg·ml-1)可輕微促進(jìn)IL-1amRNA的表達(dá)，而PGE2(20μM)抑制IL-1amRNA的表達(dá)，兩者合用，GLB為200μg·ml-1的濃度時(shí)可部分對(duì)抗PGE2的抑制作用(P=0.018)。與此同時(shí)，GLB(200μg·ml-1)可以促進(jìn)TNF-αmRNA的表達(dá)，相反，PGE2(20μM)產(chǎn)生抑制作用。兩者合用，GLB(200μg·ml-1)可部分對(duì)抗PGE2對(duì)TNF-αmRNA表

8、達(dá)的抑制作用(P=0.010)。 培養(yǎng)12小時(shí)后，GLB(200μg·ml-1)可以促進(jìn)IL-2mRNA的表達(dá)，相反，PGE2(20μM)產(chǎn)生抑制作用。兩者合用，GLB(200μg·ml-1)可部分對(duì)抗PGE2對(duì)IL-2mRNA表達(dá)的抑制作用(P=0.003)。 結(jié)論： 1.靈芝多糖促進(jìn)荷瘤小鼠脾細(xì)胞增殖、促進(jìn)TNF-α、IFN-γ產(chǎn)生與激動(dòng)TLR4有關(guān)。 2.靈芝多糖促進(jìn)TNF-α產(chǎn)生的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制可能