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文檔簡介
1、本課題以本所自行成功研制的鼠抗人CD40激發(fā)型單克隆抗體5C11為研究對象,借助計算機輔助分子設(shè)計與蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)模擬技術(shù),利用抗原-抗體相互作用原理,計算機模擬得到抗原CD40與抗體5C11的主要結(jié)合位點,從而推測出抗體識別的抗原表位;結(jié)合文獻報道的CD40-CD40L互相作用位點,通過定點突變技術(shù)、構(gòu)建突變體基因轉(zhuǎn)染細胞株等生物學(xué)實驗方法,驗證計算機模建結(jié)果的可靠性,從而確定抗體識別的抗原表位,對5C11抗體進行人源化改造或研制抗人
2、CD40抗體臨床用藥具有理論和潛在的臨床意義。
目的:通過計算機模擬與生物實驗,初步確定本所研制的抗人CD40激發(fā)型單抗5C11識別的抗原表位。
方法:利用InsightⅡ軟件分別模擬抗原、抗體結(jié)構(gòu),以及搭建抗原抗體復(fù)合物模型,通過計算并推測抗體所識別的抗原表位。通過RT-PCR的方法分別獲得人野生型CD40(wtCD40)和70位突變(70muCD40)及114位突變(114muCD40)的全長基因,構(gòu)建重
3、組真核表達載體pIRES2-EGFP/wtCD40、pIRES2-EGFP/70muCD40和pIRES2-EGFP/114muCD40并進行鑒定;脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組表達載體導(dǎo)入HEK293細胞;RT-PCR和FCM的方法鑒定重組表達載體;FCM、Western Blot法比較5C11分別與HEK293/wtCD40、HEK293/70muCD40和HEK293/114muCD40基因轉(zhuǎn)染細胞株的結(jié)合。
結(jié)果:(1)搭建合
4、理的抗原CD40胞外段與抗體5C11 Fv結(jié)構(gòu)的復(fù)合物模型。(2)酶切和測序結(jié)果均證實成功構(gòu)建3個真核表達載體;RT-PCR和FCM檢測結(jié)果表明,表達載體成功轉(zhuǎn)染入HEK293細胞。(3)FCM結(jié)果表明5C11與HEK293/70muCD40和HEK293/114muCD40結(jié)合較之與HEK293/wtCD40結(jié)合的平均熒光強度有減弱的趨勢;Western blot檢測結(jié)果表明5C11僅識別HEK293/wtCD40,不識別HEK293
5、/70muCD40和HEK293/114muCD40。由此表明5C11識別HEK293/70muCD40和HEK293/114muCD40的能力降低。
結(jié)論:預(yù)測5C11識別的抗原表位是15-17、23、43-56、68-80、85、87、100-115;成功構(gòu)建HEK293/wtCD40、HEK293/70muCD40和HEK293/114muCD40基因轉(zhuǎn)染細胞株,證實人CD40序列的第70位蘇氨酸和第114位谷氨酸是
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