中藥復(fù)方桃紅四物湯對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、目的：本研究旨在觀察中藥湯劑桃紅四物湯直接作用于體外培養(yǎng)大鼠肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSCs），對(duì)其凋亡的影響，以及桃紅四物湯通過(guò)刺激大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(marrow mesenchymal stem cells，MSCs）旁分泌細(xì)胞因子,進(jìn)而在上述兩種細(xì)胞組成的共培養(yǎng)體系中對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞的凋亡產(chǎn)生的影響。
　　方法：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離：在無(wú)菌條件下分離SD雄性大鼠股骨骨髓，采用貼壁培養(yǎng)法

2、進(jìn)行骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)、純化和擴(kuò)增，傳代至第4代使用。大鼠肝星狀細(xì)胞系（HSC-T6）復(fù)蘇后傳代使用。用6孔塑料細(xì)胞培養(yǎng)板，在半透膜(transwell insert)上層接種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(2×105cells/well),在下層接種大鼠肝星狀細(xì)胞(2×105cells/well),建立上下雙層細(xì)胞共培養(yǎng)體系，常規(guī)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分四個(gè)組：大鼠肝星狀細(xì)胞空白對(duì)照組即大鼠肝星狀細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)；大鼠肝星狀細(xì)胞用藥刺激組用桃紅四物湯藥液含量為1

3、0％、15%、20%的完全培養(yǎng)基，直接作用于大鼠肝星狀細(xì)胞24小時(shí)；空白共培養(yǎng)組常規(guī)共培養(yǎng)；加藥刺激共培養(yǎng)組用桃紅四物湯藥液含量為10%、15%、20%的完全培養(yǎng)基刺激大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞3小時(shí)后，將大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與大鼠肝星狀細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)。大鼠肝星狀細(xì)胞直接用藥組：以正常單獨(dú)培養(yǎng)大鼠肝星狀細(xì)胞作為對(duì)照，于倒臵相差顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞形態(tài)，用噻唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)桃紅四物湯對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞的增殖抑制率。用逆轉(zhuǎn)錄PCR(reve

4、rse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）法檢測(cè)大鼠肝星狀細(xì)胞的凋亡相關(guān)基因Bax mRNA和凋亡抑制基因Bcl-2 mRNA表達(dá)變化，DNA凝膠電泳（DNA Ladder）法檢測(cè)大鼠肝星狀細(xì)胞凋亡。加藥共培養(yǎng)組：以正?？瞻坠才囵B(yǎng)組作為對(duì)照比較。通過(guò)RT-PCR法和DNA Ladder法檢測(cè)各組大鼠肝星狀細(xì)胞的凋亡情況及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因（HGF mRNA）表

5、達(dá)情況，并用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測(cè)共培養(yǎng)上清液中肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子濃度。
　　結(jié)果：MTT法檢測(cè)，桃紅四物湯直接刺激組，大鼠肝星狀細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的增殖抑制（P<0.01），且呈現(xiàn)濃度依賴性，與空白對(duì)照組比較有顯著性差異（P<0.05）。RT-PCR法檢測(cè)，直接刺激組大鼠肝星狀細(xì)胞的Bax mRNA和Bcl-2 mRNA表達(dá)與空白對(duì)照組比較，有明顯差異(P<0.05），且隨藥物濃度升高而增減，加藥刺激共培養(yǎng)組大鼠肝星狀細(xì)胞的B

6、ax mRNA和Bcl-2 mRNA表達(dá)與空白共培養(yǎng)組比較，有明顯差異（P<0.05），且隨藥物濃度升高而增減，共培養(yǎng)各組間大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因(HGF mRNA）的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。DNA Ladder法檢測(cè)，直接刺激組、加藥刺激共培養(yǎng)組和空白共培養(yǎng)組中的大鼠肝星狀細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的DNA Ladder條帶，空白對(duì)照組的大鼠肝星狀細(xì)胞未出現(xiàn)DNA Ladder條帶。ELISA法檢測(cè)，加藥刺激共培養(yǎng)