裂褶菌培養(yǎng)基形態(tài)學(xué)觀察及致病性的動物試驗研究.pdf

1、目的:裂褶菌(Schizophyllum commune)屬真菌門,擔子菌綱,傘菌目,裂褶菌科,裂褶菌屬,廣泛分布于世界各地。該菌多寄生于腐木上,是林木常見的致病真菌。在對人類致病性方面,臨床上以吸入其孢子引起過敏反應(yīng)較為常見,而由該菌引起人體深部組織感染病例罕見,但近年來國外有關(guān)該菌引起人體深部組織感染的報道逐漸增多。本研究所用菌株分離自我科會診病人的痰液,經(jīng)中國科學(xué)院微生物研究所鑒定為Schizophyllam commune。

2、r>　　 本研究一方面通過對裂褶菌在五種不同培養(yǎng)基上的形態(tài)學(xué)特征進行觀察,尋找更適合其生長的培養(yǎng)基,為臨床上診斷裂褶菌感染提供實驗室依據(jù);另一方面,采用動物實驗的方法,將裂褶菌懸液分別經(jīng)皮下、腹腔及靜脈途徑接種于不同免疫狀態(tài)的小鼠體內(nèi),觀察小鼠28天內(nèi)的死亡率,并通過組織真菌逆培養(yǎng)、組織載菌量測定及組織病理學(xué)等檢查,比較不同免疫狀態(tài)下小鼠心、肝、脾,肺和腎等主要臟器的感染程度,為進一步了解此菌的致病力及其引起的組織病理學(xué)改變提供實驗室

3、依據(jù)。
　　 方法:1 DNA序列分析提取分離菌DNA,PCR擴增其26SrDNA近5’端D1/D2區(qū)域,在DNA自動測序儀上進行直接雙向測序確定堿基位點,通過GenBank/EMBL/DDBJ核酸序列數(shù)據(jù)庫進行同源序列檢索,通過系統(tǒng)樹顯示其親緣關(guān)系。
　　 2菌落形態(tài)學(xué)觀察
　　 2.1五種平皿培養(yǎng)基上菌落大體形態(tài)學(xué)觀察將我科保存菌株常溫復(fù)蘇3天,分別接種于沙堡氏瓊脂培養(yǎng)基(SDA),麥芽浸膏瓊脂(MEA)、馬

4、鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA),玉米粉瓊脂(CMA)和察氏瓊脂(CZA)上,分別置于27℃和37℃恒溫箱培養(yǎng)2周,觀察菌落生長情況、測量菌落直徑并繪制生長曲線。
　　 2.2小培養(yǎng)(方塊法)將裂褶菌分別點種于以上五種培養(yǎng)基的小培養(yǎng)上,27℃和37℃恒溫箱培養(yǎng)2周,觀察菌絲生長、產(chǎn)孢情況。
　　 2.3光鏡觀察取五種培養(yǎng)基生長良好的菌落標本置于載玻片上,經(jīng)乳酸酚棉蘭染色,光鏡下觀察。
　　 2.4掃描電鏡觀察取SDA培養(yǎng)

5、基兩個溫度下培養(yǎng)7天的菌落標本,置于4％的戊二醛中固定,常規(guī)制片后在掃描電鏡下觀察。
　　 3生理學(xué)實驗
　　 3.1尿素酶試驗將菌落接種于尿素瓊脂培養(yǎng)基上,室溫培養(yǎng)1周,觀察培養(yǎng)基變色情況。
　　 3.2放線菌酮抑制試驗將菌落分別接種于含有放線菌酮和不含放線菌酮的沙堡瓊脂培養(yǎng)基上,27℃和37℃恒溫箱培養(yǎng)2周,觀察菌落生長情況。
　　 4動物的致病性試驗
　　 4.1裂褶菌系統(tǒng)感染動物模型的制作

6、將保存菌株復(fù)蘇,轉(zhuǎn)種于SDA培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)7天。用無菌生理鹽水制備成菌懸液,通過皮下、腹腔、靜脈三種途徑接種至不同免疫狀態(tài)的小鼠。
　　 4.2死亡率觀察連續(xù)觀察各組小鼠感染該菌后28天內(nèi)的自然死亡情況,記錄死亡日期和死亡只數(shù)。
　　 4.3感染內(nèi)臟大體觀察將不同感染時間的小鼠分批處死進行解剖,分別取出心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟,觀察各臟器是否腫大或萎縮、有無顏色改變等大體形態(tài)改變。
　　 4.4組織真菌逆

7、培養(yǎng)無菌條件下將各臟器用組織研磨器研碎后挑取少許分別接種于含沙堡氏瓊脂培養(yǎng)基的試管中,37℃恒溫箱培養(yǎng)一周,統(tǒng)計各組小鼠內(nèi)臟逆培養(yǎng)陽性數(shù)。培養(yǎng)陽性的菌落分別移種至平皿培養(yǎng)基及小培養(yǎng)的培養(yǎng)基上培養(yǎng),觀察其菌落形態(tài)以及菌絲和孢子的形態(tài)。
　　 4.5臟器真菌載菌量測定無菌條件下取小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟,勻漿后分別進行組織的真菌平皿培養(yǎng),計算各臟器的真菌載.菌量。
　　 4.6組織病理學(xué)檢查切取接種菌懸液小鼠的心臟

8、、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟等臟器,用10％福爾馬林溶液固定,常規(guī)脫水、透明、包埋、切片,進行HE和PAS染色,光鏡下觀察其組織病理學(xué)改變。
　　 結(jié)果:
　　 1 DNA序列分析結(jié)果基于26SrDNA D1/D2區(qū)序列和Neighbor-Joining分析繪制的系統(tǒng)樹,示該菌株與Schizophyllum commune具有的100％同源性。
　　 2五種培養(yǎng)基菌株的大體形態(tài)學(xué)觀察五種培養(yǎng)基上均有菌落生長,菌落均為

9、蓬松的白色羊毛狀。菌落在沙堡氏瓊脂培養(yǎng)基(SDA),麥芽浸膏瓊脂培養(yǎng)基(MEA)、馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA)上第1周生長速度較快;在察氏培養(yǎng)基(CDA)、玉米瓊脂培養(yǎng)基(CMA)上生長速度略慢。
　　 3五種培養(yǎng)基上菌落直徑裂褶菌在五種培養(yǎng)基上第1周生長較快,生長速度與時間呈正比。同一溫度菌落生長第7天和第14天時,不同培養(yǎng)基菌落直徑比較無顯著性差異(P＞0.05);同一種培養(yǎng)基在37℃菌落直徑均較27℃大,有顯著性差異(P＜0

10、.05)。
　　 4光鏡下觀察可見發(fā)達的分枝分隔菌絲,菌絲直徑差別較大,在分隔處可見閉鎖聯(lián)合。在菌絲表面上常常發(fā)現(xiàn)側(cè)生釘狀突起。SDA培養(yǎng)基上可見類水母狀變異體;擔孢子呈長圓型。
　　 5掃描電鏡觀察可見發(fā)達的分枝分隔菌絲,在分隔處產(chǎn)生閉鎖聯(lián)合。在菌絲表面上可見較多短且彎曲的側(cè)生的釘狀突起及淚滴狀或球形分泌,未見孢子。
　　 6生理學(xué)實驗?zāi)蛩孛冈囼炾栃?放線菌酮耐受試驗陰性。
　　 7小鼠感染后生存狀況免

11、疫正常小鼠接種裂褶菌后,其生活習(xí)性無明顯改變。皮下接種組小鼠背部接種部位出現(xiàn)一結(jié)節(jié)。免疫抑制腹腔組及免疫抑制靜脈組小鼠的進食量明顯減少,并逐漸消瘦。
　　 8小鼠感染后的死亡情況免疫抑制靜脈組在接種后第4達到死亡高峰,至16天止,死亡率高到85％;免疫抑制腹腔組在接種該菌后3天開始出現(xiàn)死亡,第6天達到高峰,至12天止,死亡率為35％;其余各組均無自然死亡。免疫抑制靜脈組及免疫抑制腹腔組小鼠的死亡率及平均存活天數(shù)有顯著性差異(P＜

12、0.05)。
　　 9臟器的大體改變部分免疫抑制腹腔組和靜脈組小鼠臟器表面可見白色化膿性病灶,其中以肝臟表面膿灶為多見。其它各組小鼠各臟器無明顯大體改變。
　　 10組織真菌逆培養(yǎng)小鼠內(nèi)臟組織培養(yǎng)3天后見部分臟器有菌落生長,其菌落形態(tài)及鏡下形態(tài)均與接種的菌株相同。
　　 11臟器真菌載菌量無論免疫正常還是免疫抑制狀態(tài)下,腹腔注射組肝臟和脾臟感染程度較重,與肺臟、心臟和腎臟相比較有顯著性差異(P＜0.05);靜脈注

13、射組肝臟感染程度最為嚴重,與其它臟器比較有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 12肝臟真菌載菌量免疫抑制靜脈組肝臟感染程度最為嚴重,與免疫抑制腹腔組、免疫正常靜脈組和腹腔組相比較,有顯著性差異(P＜0.05);免疫抑制腹腔組、免疫正常靜脈組和腹腔組相比較,肝臟感染程度無顯著性差異(P＞0.05)。
　　 13組織病理學(xué)檢查 HE染色早期為急性炎細胞浸潤,可見組織細胞變性壞死;后期可見組織細胞及多核細胞反應(yīng)性增生及纖維組織

14、增生。PAS染色可見炎癥組織中紫紅色分支菌絲。
　　 結(jié)論:1裂褶菌只有絲狀型一種菌落形態(tài),在沙堡瓊脂培養(yǎng)基(SDA)上生長狀態(tài)較好,并且在37℃生長較27℃良好。裂褶菌尿素酶試驗陽性;放線菌酮可抑制該菌生長。
　　 2通過腹腔和靜脈注射途徑可以成功建立裂褶菌系統(tǒng)性感染小鼠模型。皮下注射接種則未見致系統(tǒng)性感染。
　　 3裂褶菌引起的主要臟器的組織病理學(xué)改變?yōu)檎婢腥镜募甭匝装Y,即非特異性炎癥改變。免疫抑制狀態(tài)小