普通裂褶菌形態(tài)學(xué)觀察及小鼠體內(nèi)藥物敏感性實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:普通裂褶菌(Schizophyllum commune)屬真菌門,擔(dān)子菌綱,傘菌目,裂褶菌科,裂褶菌屬,廣泛分布于自然界,多在春至秋季節(jié)生長,屬于木腐生菌,野生于闊葉樹及針葉樹的枯枝倒木上,有的也發(fā)生在枯死的禾本科植物、竹類或野草上。在對人類致病方面,臨床以吸入其孢子引起過敏反應(yīng)比較常見,近年來臨床上由普通裂褶菌感染引起人類和犬齒動物.狗深部組織真菌病的病例報道日漸增多,自1950年Kligman首次報道普通裂褶菌感染人類引起甲真

2、菌病,60年來有關(guān)該菌感染引起體表或深部組織真菌病的病例報道近50例。普通裂褶菌作為一種潛在的條件致病菌日益受到臨床及實(shí)驗(yàn)室的重視。本研究所用菌株分離自1例心臟搭橋術(shù)后患變應(yīng)性支氣管肺真菌病(ABPM)的患者的痰液,經(jīng)中國科學(xué)院微生物研究所鑒定為Schizophyllum commune。
　　 本研究一方面通過對普通裂褶菌形態(tài)學(xué)觀察,為臨床上診斷普通裂褶菌感染提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù);另一方面,采用動物實(shí)驗(yàn)的方法,建立系統(tǒng)性普通裂褶菌感

3、染小鼠模型,應(yīng)用氟康唑、伊曲康唑、特比萘芬三種常用抗真菌藥物治療系統(tǒng)性普通裂褶菌感染小鼠,通過對實(shí)驗(yàn)小鼠中位生存時間和生存率以及小鼠內(nèi)臟(心、肝、脾、肺、腎)組織的真菌逆培養(yǎng)陽性率和肝臟組織載菌量的檢測來評價它們在小鼠體內(nèi)抗普通裂褶菌活性,為臨床上治療系統(tǒng)性普通裂褶菌感染提供依據(jù)。
　　 方法:
　　 1、形態(tài)學(xué)觀察
　　 1.1菌落大體形態(tài)學(xué)觀察將我科保存菌株常溫復(fù)蘇3天,接種于含氯霉素的沙堡氏瓊脂培養(yǎng)基(SD

4、A)上,置于27℃和37℃恒溫箱交替光照環(huán)境下培養(yǎng)4周,觀察菌落生長情況。
　　 1.2小培養(yǎng)(方塊法)將普通裂褶菌點(diǎn)種于含氯霉素的沙堡氏瓊脂培養(yǎng)基(SDA)的小培養(yǎng)上,27℃和37℃恒溫箱培養(yǎng)2周,觀察菌絲生長情況。
　　 1.3光鏡觀察取其菌絲標(biāo)本置于載玻片上,10％KOH溶液溶解后,蓋上蓋玻片,光鏡下觀察菌絲形態(tài)。
　　 2、小鼠體內(nèi)藥敏試驗(yàn)
　　 2.1系統(tǒng)性普通裂褶菌感染動物模型的制作將我科保存

5、菌株復(fù)蘇,轉(zhuǎn)種于SDA培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)7天。用無菌生理鹽水制備成菌懸液,接種于小鼠體內(nèi)使其感染,解剖小鼠分離出恢復(fù)毒力的菌株。分離出的菌株用無菌生理鹽水制成菌懸液,通過腹腔注射途徑接種于應(yīng)用環(huán)磷酰胺免疫抑制的小鼠。
　　 2.2給藥方法接種后第二天開始給藥,氟康唑、伊曲康唑、特比萘芬的給藥劑量分別為:52mg/Kg、26mg/Kg和32.5mg/Kg,腹腔注射,1天1次,連續(xù)5天。
　　 2.3生存觀察連續(xù)觀察各組小鼠

6、感染該菌后21天內(nèi)的自然死亡情況,記錄死亡日期和死亡只數(shù)。
　　 2.4組織真菌逆培養(yǎng)無菌條件下將各臟器用組織研磨器研碎后挑取少許分別接種于含氯霉素的沙堡氏瓊脂平皿培養(yǎng)基中,37℃恒溫箱培養(yǎng),統(tǒng)計各組小鼠內(nèi)臟逆培養(yǎng)陽性數(shù)。培養(yǎng)陽性的菌落分別移種至平皿培養(yǎng)基及小培養(yǎng)的培養(yǎng)基上培養(yǎng),觀察其菌落形態(tài)以及菌絲的形態(tài)。
　　 2.5肝臟真菌載菌量測定無菌條件下取各組死亡小鼠的肝臟,勻漿后進(jìn)行組織的真菌平皿培養(yǎng),計算肝臟的真菌載菌量

7、。
　　 結(jié)果:
　　 1、大體菌落觀察沙堡氏瓊脂培養(yǎng)基(SDA)上37℃培養(yǎng)2-3天菌落開始生長,1周后菌落直徑約7cm,菌落中央形成同心狀環(huán)紋區(qū),菌絲白色,棉毛至羊毛狀,濃密厚重,堆積高出于培養(yǎng)基表面,菌落表面出現(xiàn)微黃色液滴滲出物,培養(yǎng)基背面初為白色,其后變?yōu)榈S色。釋放出一種類似沼氣的難聞的氣味,在光照與黑暗交替的環(huán)境下,27℃和37℃恒溫箱培養(yǎng)4周未見擔(dān)子果形成。
　　 2、光鏡下觀察可見發(fā)達(dá)的分支分隔菌

8、絲,菌絲直徑差別較大,在分隔處可見閉鎖聯(lián)合。在菌絲表面上常常發(fā)現(xiàn)側(cè)生釘狀突起,未見擔(dān)子及擔(dān)孢子形成。
　　 3、小鼠感染后生存狀況小鼠接種菌懸液后,進(jìn)食明顯減少,并逐漸消瘦,活動減少,精神差,給予藥物治療后,氟康唑組和伊曲康唑組小鼠進(jìn)食增加,精神狀況改善,而生理鹽水對照組和特比萘芬組小鼠未見明顯變化。
　　 4、感染后死亡情況接種后第3天開始出現(xiàn)自然死亡,生理鹽水對照組第6天達(dá)死亡高峰,第15天止,死亡22只;氟康唑組第

9、7天達(dá)死亡高峰,第11天止,死亡9只;伊曲康唑組第7天達(dá)死亡高峰,第10天止,死亡8只;特比萘芬組第6-7天為死亡高峰,第14天小鼠不再死亡,死亡20只,與生理鹽水對照組相比,21天觀察期內(nèi)生存率和中位生存天數(shù)有著顯著性差異(p＜0.05)。
　　 5、臟器的大體改變各組實(shí)驗(yàn)小鼠內(nèi)臟均有不同程度的病理變化,部分小鼠臟器表面可見白色化膿性病灶,以肝臟多見。
　　 6、臟器組織病理HE染色可見大量炎細(xì)胞浸潤形成的化膿性肉芽腫

10、病變,PAS染色除腎臟外,均可在組織中看到紫紅色的分支菌絲。
　　 7、組織真菌逆培養(yǎng)部分小鼠內(nèi)臟組織培養(yǎng)3天后可見白色菌落生長,其菌落形態(tài)及鏡下結(jié)構(gòu)與實(shí)驗(yàn)菌株一致。肝、脾逆培養(yǎng)陽性率:氟康唑組和伊曲康唑組較生理鹽水對照組和特比萘芬組低,有顯著性差異,氟康唑組和伊曲康唑組、生理鹽水對照組和特比萘芬組之間無顯著性差異。肺臟逆培養(yǎng)陽性率:氟康唑組與生理鹽水對照組和特比萘芬組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義;各組小鼠心、腎逆培養(yǎng)陽性率較低,無顯著

11、性差異。
　　 8、肝臟組織載菌量氟康唑組、伊曲康唑組、特比萘芬組肝臟組織載菌量較生理鹽水對照組明顯減少,氟康唑組與伊曲康唑組、特比萘芬組與生理鹽水對照組之間肝臟組織載菌量無顯著變化,氟康唑組與特比萘芬組、伊曲康唑組與特比萘芬組之間肝臟組織載菌有顯著差異。
　　 結(jié)論:
　　 1、氟康唑和伊曲康唑在小鼠體內(nèi)均有較好的抗普通裂褶菌活性,顯著提高了肝、脾組織的真菌清除率,降低了肝臟組織載菌量,延長了小鼠生存時間,提高