奶牛β-酪蛋白啟動子的結(jié)構(gòu)改造和功能分析.pdf

1、[目的]
　　 乳腺生物反應(yīng)器具有巨大的市場前景，目前制約其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的主要原因之一就是對乳腺特異基因表達(dá)調(diào)控機制認(rèn)識不足和缺乏可在乳腺中高效、特異表達(dá)的載體。本研究以β-酪蛋白3’-端調(diào)控區(qū)序列替換掉熒光素酶報告基因表達(dá)載體pGL3-Basic的SV40 late poly(A)序列而構(gòu)建出新的重組載體pGL3-F；采用重疊PCR技術(shù)將SV40增強子序列分別插入研究小組之前構(gòu)建的7種重組β-酪蛋白啟動子(rp-1、rp-2、r

2、p-3、rp-4、rp-5、rp-6S和op-0)中，從而構(gòu)建出7種新的重組β-酪蛋白啟動子，并對它們在2種不同重組載體中引導(dǎo)熒光素酶報告基因表達(dá)的活性進行檢測和對照分析，目的是要系統(tǒng)地觀察：
　　 (1)β-酪蛋白3’-端調(diào)控序列對重組載體中重組β-酪蛋白啟動子引導(dǎo)熒光素酶報告基因表達(dá)活性的影響，探討用β-酪蛋白3’-端調(diào)控序列替換載體中的SV40late poly(A)序列后，與重組β-酪蛋白啟動子配對構(gòu)建奶牛乳腺定位表達(dá)載

3、體的可能性：
　　 (2)在重組β-酪蛋白啟動子中插入SV40增強子序列對β-酪蛋白啟動子引導(dǎo)熒光素酶報告基因表達(dá)活性的影響，探討通過在重組β-酪蛋白啟動子插入外來增強子序列以提高β-酪蛋白啟動子引導(dǎo)基因表達(dá)活性的途徑；
　　 (3)通過對重組載體中的重組β-酪蛋白啟動子的活性進行檢測和對照分析，篩選出活性最強的重組β-酪蛋白啟動子，用以進一步構(gòu)建奶牛乳腺高效定位表達(dá)載體，為開展奶牛乳腺生物反應(yīng)器的研究奠定基礎(chǔ)：

4、　　 (4)通過在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入催乳素或皮質(zhì)激素的方法，觀察催乳素和皮質(zhì)激素對重組β-酪蛋白啟動子引導(dǎo)熒光素酶報告基因表達(dá)活性的影響。
　　 [方法]
　　 PCR擴增獲取奶牛β-酪蛋白3’-端調(diào)控序列，并將其替換掉熒光素酶報告基因載體pGL3-Basic的SV40 late poly(A)序列，獲得重組載體pGL3-F。
　　 設(shè)計1對PCR引物，擴增出研究組之前經(jīng)初步改造得到的7種重組β-酪蛋白啟動子rp

5、-1、rp-2、rp-3、rp-4、rp-5、rp-6和op-0。分別克隆至含β-酪蛋白3’-端調(diào)控序列的重組載體pGL3-F上，獲得7種含不同重組β-酪蛋白啟動子的重組載。
　　 設(shè)計3對重疊PCR引物，分別擴增出7對β-酪蛋白啟動子2 kb5’-端片段、1 kb3’-端片段和SV40增強子序列，以重疊PCR技術(shù)分別將上述7對片段拼接到SV40增強子序列的兩端，構(gòu)建出7種中間含SV40增強子序列的重組β-酪蛋白啟動子rp-1S

6、、rp-2S、rp-3S、rp-4S、rp-5S、rp-6S和op-0S。
　　 將這7種重組β-酪蛋白啟動子(4p-1S、rp-2S、rp-3S、rp-4S、rp-5S、rp-6S和op-0S)分別克隆至熒光素酶報告基因載體pGL3-Basic上，獲得7種含不同重組β-酪蛋白啟動子的重組載體。
　　 另將這7種重組β-酪蛋白啟動子(rp-1S、rp-2S、rp-3S、rp-4S、rp-5S、rp-6S和op-0S)分別

7、克隆至含β-酪蛋白3’-端調(diào)控區(qū)序列的重組熒光素酶報告基因載體pGL3-F上，獲得7種含不同重組β-酪蛋白啟動子的重組載體。
　　 采用脂質(zhì)體技術(shù)分別將這些重組載體轉(zhuǎn)染至乳腺癌細(xì)胞MCF-7，通過雙熒光素酶檢測系統(tǒng)檢測這些重組表達(dá)載體中的不同重組β-酪蛋白啟動子在乳腺癌細(xì)胞MCF-7中引導(dǎo)熒光素酶報告基因表達(dá)的效能，并通過在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入催乳素或皮質(zhì)醇激素的方法，觀察催乳素和皮質(zhì)醇激素對重組β-酪蛋白啟動子引導(dǎo)熒光素酶報告基因

8、表達(dá)活性的影響。
　　 [結(jié)果]
　　 PCR擴增、酶切產(chǎn)物電泳和測序鑒定結(jié)果表明：
　　 (1)通過PCR擴增獲取奶牛β-酪蛋白基因3’-端調(diào)控序列，并成功用它替換掉了熒光素酶報告基因載體pGL3-Basic的SV40 late poly(A)序列，獲得重組載體pGL3-F。
　　 (2)采用PCR技術(shù)成功克隆出研究組之前經(jīng)初步改造得到的7種重組β-酪蛋白啟動子，并成功將它們分別克隆至pGL3-F載體中

9、，獲得7種含熒光素酶報告基因、β-酪蛋白3’-端調(diào)控區(qū)和不同結(jié)構(gòu)的重組β-酪蛋白啟動子的重組載體。
　　 (3)采用重疊PCR拼接技術(shù)成功構(gòu)建出了內(nèi)含SV40增強子序，且分別剔除掉5’-端調(diào)控區(qū)內(nèi)所含的負(fù)調(diào)控序列、負(fù)調(diào)控序列和轉(zhuǎn)座子序列重疊區(qū)、轉(zhuǎn)座子序列等片段，從而得到具有不同序列結(jié)構(gòu)的7種重組β-酪蛋白啟動子rp-1S、rp-2S、rp-3S、rp-4S、rp-5S、rp-6S和op-0S。
　　 (4)成功將7種內(nèi)含

10、SV40增強子序列的重組β-酪蛋白啟動子分別克隆至熒光素酶報告基因載體pGL3-Basic中，獲得7種含熒光素酶報告基因和不同結(jié)構(gòu)的重組β-酪蛋白啟動子的重組載體。
　　 (5)成功將內(nèi)含SV40增強子序列的重組β-酪蛋白啟動子分別克隆至含有β-酪蛋白3’-端調(diào)控區(qū)序列的pGL3-F載體中，獲得7種含熒光素酶報告基因、β-酪蛋白3’-端調(diào)控區(qū)和不同結(jié)構(gòu)的重組β-酪蛋白啟動子的重組載體。
　　 (6)雙熒光素酶報告系統(tǒng)分析

11、測定結(jié)果顯示，與天然的奶牛β-酪蛋白啟動子op-0相比，重組載體rp-1S-pGL3-Basic中的重組β-酪蛋白啟動子rp-1S的活性最高，其引導(dǎo)熒光素酶報告基因表達(dá)的活性是原始β-酪蛋白啟動子op-0活性的7577％。
　　 (7)對啟動子rp-1S的激素調(diào)控分析結(jié)果表明，催乳素增強其引導(dǎo)熒光素酶表達(dá)的活性，而皮質(zhì)醇激素對其活性無顯著影響。
　　 [結(jié)論]
　　 (1)用β-酪蛋白3’-端調(diào)控區(qū)序列替換掉pG

12、L3-Basic載體中的SV40 latepoly(A)序列后，對重組載體中的重組β-酪蛋白啟動子引導(dǎo)熒光素酶報告基因表達(dá)的活性有一定的影響，但不足以影響用β-酪蛋白3’-端調(diào)控區(qū)序列與重組β-酪蛋白啟動子配對構(gòu)建奶牛乳腺定位表達(dá)載體的可行性；
　　 (2)在重組β-酪蛋白啟動子中插入SV40增強子序列可顯著提高本研究小組之前經(jīng)初步結(jié)構(gòu)改造得到的7種重組β-酪蛋白啟動子引導(dǎo)熒光素酶報告基因表達(dá)的活性；
　　 (3)成功構(gòu)