薺菜冷響應基因(COR15)及其啟動子的克隆和功能分析.pdf

1、溫度是影響植物地域分布、生長和發(fā)育以及農(nóng)作物質(zhì)量和產(chǎn)量的重要限制因子之一。隨著轉基因技術的日益成熟，人們已從植物中分離了大批抗寒相關基因用于抗寒植物的培育。但利用抗寒相關基因進行轉基因抗寒植物培育時均發(fā)現(xiàn)在獲得優(yōu)良低溫抗性植株的同時，普遍出現(xiàn)不同程度的生長延滯現(xiàn)象。主要是利用抗寒相關基因進行的轉基因植物都是在組成性啟動子CaMV(cauliflower mosaicvirus)35S驅動下產(chǎn)生的。這種基因的組成性表達對植物的生長造成了一

2、定的影響。為了克服轉基因植物出現(xiàn)的生長延滯現(xiàn)象，人們開始利用冷誘導特異性啟動子代替組成性啟動子。但目前有關冷誘導特異性啟動子的研究還較少，為了獲得具有自主知識產(chǎn)權的冷誘導啟動子，并明確該啟動子的冷誘導特性，我們開展了薺菜冷調(diào)節(jié)基因(COR15)及啟動子的克隆和功能分析，主要研究結果如下:
　　1.薺菜COR15b基因的功能研究
　　表達譜分析顯示CbCOR15b不僅在葉中表達，而且在根中也有表達。CbCOR15b-GFP載體

3、瞬時轉化顯示在煙草葉肉細胞中CbCOR15b定位于葉綠體中，在不含葉綠體的洋蔥表皮細胞中定位于細胞質(zhì)中。將CbCOR15b基因通過葉盤法轉化煙草，抗凍性分析結果表明轉基因煙草陽性苗在4℃和-4℃條件下抗凍性增強，轉基因煙草電解質(zhì)滲透率升高的不及對照組快而且多，相對水含量比對照組降低的慢而且少，葡萄糖含量比對照組增加的快而且多。說明CbCOR15b基因在細胞內(nèi)起了抗凍的作用。并且CbCOR15b過表達煙草植株沒有出現(xiàn)明顯的生長延遲現(xiàn)象，這

4、對應用該基因于抗凍育種具有重要的意義。
　　2.薺菜COR15基因啟動子的克隆和分析
　　采用genome-walking的方法克隆得到CbCOR15a和CbCOR15b基因的啟動子，通過在線網(wǎng)站the PLANTCARE分析了順式作用元件。將CbCOR15b和CbCOR15a啟動子轉化煙草，通過RT-PCR分析和GUS染色分析顯示常溫下僅CbCOR15aP在煙草葉片和根中有較低活性，低溫處理后CbCOR15aP和CbCOR

5、15bP活性在葉片和根中的活性增強。與CbCOR15aP相比，CbCOR15bP具有強烈的冷誘導性，但在常溫時不具有活性，非常適合用于抗凍基因工程育種。
　　3.薺菜COR15基因啟動子的缺失分析
　　根據(jù)CRT/DRE元件的數(shù)目，克隆了兩個啟動子的缺失片段，將缺失片段與pCAMBIA1301載體上的GUS報告基因相連后轉化擬南芥，通過GUS染色分析顯示CRT/DRE元件確為冷響應所必須，而且其數(shù)目多少影響啟動子冷響應的活性

6、。
　　4.薺菜和擬南芥COR15基因啟動子的比較分析
　　為了分析擬南芥和薺菜COR15的啟動子在低溫誘導下的活性，分別構建了AtCOR15aP∷GUS, AtCOR15bP∷GUS, CbCOR15aP∷GUS和CbCOR15bP∷GUS四個載體轉化擬南芥，通過RT-PCR分析和GUS染色分析四種啟動子冷響應特性。結果表明常溫下CbCOR15aP在幼苗全株、成熟蓮座葉、莖生葉，花序和果莢中都有較低的活性，AtCOR15a

7、P在花藥中有活性，而CbCOR15bP和AtCOR15bP在常溫下沒有活性。四個啟動子在低溫處理后活性都明顯增強，RT-PCR和GUS染色分析的結果表明4℃冷誘導1d后CbCOR15aP冷誘導活性最強，其次為CbCOR15bP，而AtCOR15aP和AtCOR15bP的冷誘導活性更弱，并且在擬南芥的根中沒有活性。
　　本研究圍繞CbCOR15b基因，對其啟動子序列、啟動子活性、蛋白定位以及功能分別做了研究，表明CbCOR15b是一