環(huán)孢菌素A對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎臟自身免疫和炎癥損傷的預(yù)防作用探討.pdf

1、第一部分環(huán)孢菌素A對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎臟病變的預(yù)防作用目的：糖尿病腎病(DN)是糖尿病最常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致終末期腎功能衰竭的主要原因。目前DN的治療原則是控制血糖、控制血壓、飲食控制和保護(hù)腎功能。仍然有一部分DM患者發(fā)生DN，一旦進(jìn)入臨床蛋白尿期，盡管基于各種干預(yù)手段，DN患者的腎功能還是會(huì)減退，約有20％發(fā)展至終末期腎病，需長(zhǎng)期堅(jiān)持透析治療或腎移植。最新病理發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在腎臟組織的浸潤(rùn)是DN受到細(xì)胞免疫損傷的

2、新證據(jù)。除此以外，炎癥機(jī)制參與了DN的發(fā)展過(guò)程。證據(jù)之一是本試驗(yàn)細(xì)胞因子例如MCP-1、RANTES和NF-KB的分子機(jī)制研究。本試驗(yàn)旨在觀察免疫抑制劑環(huán)孢菌素A(CsA)對(duì)DM大鼠腎臟病變是否具有預(yù)防作用。方法：雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠按50mg/kg體重尾靜脈注射鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)糖尿病模型。所選動(dòng)物遵循體重分層隨機(jī)原則分為正常對(duì)照組(NN組)，糖尿病組(AMN組)，胰島素干預(yù)組(AMI組)，STZ誘導(dǎo)糖尿

3、病模型前一周開(kāi)始CsA1mg/kg/d干預(yù)組(BML組)，STZ誘導(dǎo)糖尿病模型前一周開(kāi)始CsA4mg/kg/d干預(yù)組(BMM組)STZ誘導(dǎo)糖尿病模型前一周開(kāi)始CsA8mg/kg/d干預(yù)組(BMH組)，CsA1mg/kg/d干預(yù)組(AML組)，CsA4mg/kg/d干預(yù)組(AMM組)，CsA8mg/kg/d干預(yù)組(AMH組)，CsA1mg/kg/d干預(yù)正常對(duì)照組(NL組)，CsA4mg/kg/d干預(yù)正常對(duì)照組(NM組)，CsA8mg/kg

4、/d干預(yù)正常對(duì)照組(NH組)。DM大鼠誘導(dǎo)成功8周后，用生化方法檢測(cè)血糖、尿素氮、肌酐水平；免疫比濁法測(cè)定尿微量白蛋白。石蠟切片光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠腎臟的組織病理學(xué)改變。透射電鏡觀察大鼠腎臟組織的超微結(jié)構(gòu)變化。Image-proplus多功能真彩色生物圖象分析系統(tǒng)分析腎臟組織的纖維化改變。結(jié)果：AMN組出現(xiàn)明顯腎臟組織的纖維化，系膜區(qū)明顯增寬，基膜增后，近曲小管上皮細(xì)胞凋亡明顯。腎重/體重增加，尿素氮、肌酐、尿微量白蛋白顯著增加(P＜0

5、.05)。AMI組腎重/體重，肌酐、尿微量白蛋白與AMN無(wú)明顯改善(P＞0.05)，腎臟組織的纖維化、尿素氮水平降低(P＜0.05)，超微結(jié)果無(wú)明顯改善。CsA各干預(yù)組腎臟組織的纖維化明顯減輕(P＜0.05)，尿素氮、尿微量白蛋白顯著減少(P＜0.05)，腎重/體重、肌酐有所降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。CsA各干預(yù)組與AMI組相比腎臟組織的纖維化進(jìn)一步明顯減輕(P＜0.05)，尿微量白蛋白顯著減少(P＜0.05)，低劑量組腎臟

6、超微結(jié)果無(wú)明顯改善，中高劑量組腎臟超微結(jié)果無(wú)損傷。CsA干預(yù)各對(duì)照組腎臟組織的纖維化程度、腎重/體重、尿素氮、肌酐、尿微量白蛋白無(wú)明顯變化。結(jié)論：1.STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠自然病程8周可出現(xiàn)明顯的腎臟免疫損害。2.胰島素治療能在一定程度上減緩腎臟纖維化，但CsA腎保護(hù)作用即預(yù)防腎纖維化作用比胰島素治療更好。3.CsA干預(yù)對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎臟的損害有明顯的保護(hù)作用。4.CsA在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中大鼠未出現(xiàn)對(duì)大鼠腎功能的明顯的損害。

7、 第二部分環(huán)孢菌素A預(yù)防STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎臟病變的免疫學(xué)機(jī)制目的：目前觀點(diǎn)認(rèn)為糖尿病腎病是一種非免疫性腎病，但有越來(lái)越多的證據(jù)和試驗(yàn)結(jié)果表明，免疫細(xì)胞參與了糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展。淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)可導(dǎo)致非免疫性腎病腎臟固有細(xì)胞的纖維化。本試驗(yàn)旨在了解應(yīng)用CsA干預(yù)對(duì)STZ誘導(dǎo)的DM大鼠腎臟病變免疫機(jī)制的影響。方法：雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠按50mg/kg體重尾靜脈注射鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)糖尿病模型。

8、所選動(dòng)物遵循體重分層隨機(jī)原則分為正常對(duì)照組(NN組)，糖尿病組(AMN組)，胰島素干預(yù)組(AMI組)，STZ誘導(dǎo)糖尿病模型前一周開(kāi)始CsA1mg/kg/d干預(yù)組(BML組)，STZ誘導(dǎo)糖尿病模型前一周開(kāi)始CsA4mg/kg/d干預(yù)組(BMM組)STZ誘導(dǎo)糖尿病模型前一周開(kāi)始CsA8mg/kg/d干預(yù)組(BMH組)，CsA1mg/kg/d干預(yù)組(AML組)，CsA4mg/kg/d干預(yù)組(AMM組)，CsA8mg/kg/d干預(yù)組(AMH組)

9、。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血T淋巴細(xì)胞亞群分類，ELLISA法檢測(cè)免疫球蛋白的血清濃度，免疫組化法檢測(cè)CD3+T淋巴細(xì)胞在腎臟組織的浸潤(rùn)和免疫球蛋白在腎臟組織的沉積，冰凍切片免疫熒光染色技術(shù)觀察腎臟組織免疫球蛋白的局部表達(dá)。結(jié)果：AMN組外周血CD3+T細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯降低，CD4+/CD8+比值明顯降低(P＜0.01)。腎臟組織CD3+細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增多，IgA、IgG沉積明顯增強(qiáng)(P＜0.01)。AMI組外周血CD3+T細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD4+/CD

10、8+比值、腎臟組織CD3+細(xì)胞浸潤(rùn)和IgA、IgG沉積與糖尿病大鼠相比無(wú)明顯變化(P＞0.05)。CsA各干預(yù)組比AMN組外周血CD4+/CD8+比值明顯升高(P＜0.01)。腎臟組織CD3+細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，IgA、IgG沉積明顯減弱(P＜0.01)。外周血CD3+T細(xì)胞計(jì)數(shù)不同程度降低，BML和BMH組下降明顯(P＜0.05)。結(jié)論：1.STZ誘導(dǎo)的DM大鼠存在免疫功能紊亂，自身免疫功能紊亂如腎臟淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和免疫球蛋白沉積，可能是

11、DN的重要發(fā)病機(jī)制之一。2.胰島素治療對(duì)于STZ誘導(dǎo)的DM大鼠的免疫功能無(wú)明顯影響。3.CsA對(duì)STZ誘導(dǎo)的DM大鼠腎臟保護(hù)作用可能是通過(guò)對(duì)大鼠免疫干預(yù)作用實(shí)現(xiàn)的。 第三部分環(huán)孢菌素A預(yù)防STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎臟病變的炎癥機(jī)制目的：本試驗(yàn)旨在觀察CsA干預(yù)對(duì)NF-KB為中心環(huán)節(jié)、下游C-C類趨化因子參與的炎癥機(jī)制的調(diào)節(jié)作用，CsA對(duì)DN預(yù)防作用的炎性機(jī)制探討。方法：通過(guò)免疫組化法檢測(cè)核因子NF-KBP65在腎臟組織的蛋白表達(dá)和

12、激活；通過(guò)半定量逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reversetranscript-polymerasechainreaction,RT-PCR)、westernblot技術(shù)、免疫組化法，檢測(cè)C-C類趨化因子MCP-1和RANTES在DM大鼠腎臟組織的mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)。結(jié)果：AMN組大鼠腎臟組織NF-KB表達(dá)明顯增加，活化增強(qiáng)(P＜0.01)；MCP-1和RANTES在mRNA水平和蛋白水平高表達(dá)(P＜0.01)。AMI組大鼠腎臟組織

13、NF-KB表達(dá)減少，活化減弱(P＜0.05)，MCP-1和RANTES在mRNA水平和蛋白水平高表達(dá)，與AMN組無(wú)差異(P＞0.05)。CsA各干預(yù)組腎臟組織NF-KB表達(dá)明顯減低，活化減弱(P＜0.01)；MCP-1和RANTES在mRNA水平和蛋白水平低表達(dá)(P＜0.01)。CsA各干預(yù)組比AMI組NF-KB在腎臟組織表達(dá)進(jìn)一步減低，活化減弱(P＜0.01)。結(jié)論：1.DM大鼠腎臟組織中過(guò)度活化的NF-KB，高表達(dá)的趨化因子MCP-