博落回主要生物堿的分離、純化及生物活性研究.pdf

1、中藥博落回(Macleaya cordata(Willd)R.Br.)屬罌粟科博落回屬植物，富含多種異喹啉類生物堿，如血根堿(sanguinarine，SA)，白屈菜紅堿(chelerythrine，CHE)，原阿片堿(protopine，PRO)和別隱品堿(allocryptopine，ALL)等。它們具有顯著而豐富的生物活性與藥理活性，在抗癌、殺菌、殺釘螺、治肝病等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。本論文以博落回生物堿作為研究對象，在前人工作

2、的基礎(chǔ)上，圍繞博落回中的四種高活性異喹啉類生物堿的分離、純化，生物活性及其緩釋制劑開發(fā)等內(nèi)容展開研究。
　　 為系統(tǒng)研究博落回中生物堿的理化性質(zhì)，首先建立了博落回生物堿單體的分離、純化方案，采用溶劑法和柱層析法，從博落回果莢中分離出八種異喹啉類生物堿，并通過1H-NMR，13C-NMR和ESI-MS分別鑒定為：原阿片堿、別隱品堿、隱品堿、血根堿、白屈菜紅堿、二氫血根堿、氧化血根堿、二氫白屈菜紅堿。采用溶劑提取和控制pH值分離為主

3、要方法，初步建立了原阿片堿，別隱品堿，血根堿和白屈菜紅堿單體的分離、純化方案，該技術(shù)為博落回生物堿的開發(fā)與高值化利用提供了有益的參考。
　　 采用超高效液相色譜-電噴霧-質(zhì)譜(UPLC-ESI-MS)聯(lián)用技術(shù)，建立了博落回生物堿全分析方法，為博落回藥材質(zhì)量控制提供了重要依據(jù)。該分析方法能快速、高效檢測多種生物堿在博落回各部位中的含量，樣品全分析時(shí)間(11 min)約為常規(guī)HPLC分析時(shí)間(45 min)的1/3，且比常規(guī)HPLC

4、分析法具有更高的靈敏度和更少的溶劑消耗。利用本文建立的分析方法，檢測了博落回植物各部位及九種不同來源的博落回果莢中生物堿的含量。結(jié)果表明，博落回果莢中八種生物堿是含量較高的生物堿，其中的血根堿是含量最高的一種。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，不同來源的博落回果莢中生物堿含量差別較大，提示生物堿含量的變化可能是導(dǎo)致不同來源的博落回臨床療效差異的主要原因之一。
　　 博落回生物堿在血吸蟲防治方面具有良好的應(yīng)用前景，因此本文以博落回中提取的血根堿硫酸氫鹽

5、(BSAN)和白屈菜紅堿硫酸氫鹽(BCHE)及二者的比例混合物(BTA)為藥劑，研究了博落回生物堿殺滅釘螺的活性，殺螺效果依次為：BSAN>BTA>BCHE，且BTA的殺螺效果表現(xiàn)出時(shí)間-劑量的依賴性。通過透射電鏡研究了藥物對釘螺肝細(xì)胞與生殖腺細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的損害，發(fā)現(xiàn)螺肝和生殖腺均為BTA的靶器官。此項(xiàng)以博落回生物堿對釘螺肝細(xì)胞及生殖腺細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)影響的電鏡研究目前未見報(bào)道。由于BTA殺螺的LC50值(0.69 mg/l，48h；0.4

6、0 mg/l，72 h)較低，其生產(chǎn)成本又很低廉，因此BTA有望作為一種很有潛力的植物源滅螺劑進(jìn)行開發(fā)。
　　 在抗肝纖維化藥理實(shí)驗(yàn)中，主要針對博落回中提取的別隱品堿治療小鼠日本血吸蟲病肝纖維化的藥理活性進(jìn)行了研究。采用日本血吸蟲尾蚴皮膚敷貼法成功建立了小鼠日本血吸蟲病肝纖維化動物模型，并通過小鼠的急毒試驗(yàn)測定別隱品堿的LD50值為562.4 mg/kg。經(jīng)別隱品堿給藥治療后，光學(xué)鏡檢的病理觀察發(fā)現(xiàn)，中、高劑量組的小鼠肝細(xì)胞的纖

7、維間隔較模型組明顯減少，肉芽腫有所減輕，肝纖維化程度大多為Ⅰ至Ⅱ級。電子顯微鏡的超微結(jié)構(gòu)病理研究表明，別隱品堿高劑量組的小鼠肝細(xì)胞的纖維分布減少，病變程度和病變范圍均比模型組和吡喹酮組明顯減輕。小鼠血清學(xué)肝纖維化指標(biāo)與肝組織免疫組化指標(biāo)的變化也顯示，別隱品堿對小鼠日本血吸蟲病肝纖維化具有一定的治療作用，此項(xiàng)研究以前也未見報(bào)道。
　　 為了研究博落回中的生物堿在體內(nèi)與蛋白質(zhì)等生物大分子的作用機(jī)理，采用熒光光譜技術(shù)測定了SA、CHE

8、與牛血清白蛋白(BSA)的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)、作用距離、相互作用的熱力學(xué)參數(shù)，研究了SA、CHE對BSA分子構(gòu)象的影響。采用密度泛函理論中的B3LYP/6-31G*方法對SA、CHE的前線軌道進(jìn)行了電荷分析，研究了分子結(jié)構(gòu)與電荷分布對它們與BSA分子相互作用的影響。通過同源建模技術(shù)獲得了BSA分子的空間結(jié)構(gòu)，采用分子對接技術(shù)模擬了SA和CHE分子與BSA相互作用的空間構(gòu)象和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，計(jì)算了SA和CHE分子與BSA相互作用的AG值分別

9、為-30.29 kJ·mol-1和-29.45kJ·mol-1，分子模擬所得的結(jié)論與熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為接近。本實(shí)驗(yàn)為深入研究血根堿、白屈菜紅堿與蛋白質(zhì)的作用機(jī)理提供了實(shí)驗(yàn)和理論上的依據(jù)。
　　 本課題還進(jìn)一步研究了博落回生物堿的制劑技術(shù)，選取具有抗腫瘤作用的白屈菜紅堿作為模型藥物，以羧甲基殼聚糖(CMCS)為高分子載體材料，通過乳化化學(xué)交聯(lián)法制備了包覆CHE·HCl的CMCS微球。并采用基于Box-Behknd設(shè)計(jì)的響應(yīng)曲面法(r

10、esponse surfacemethodology，RSM)與滿意度函數(shù)(Desirability)對CHE·HCl/CMCS微球制備工藝的主要參數(shù)進(jìn)行了多目標(biāo)、多響應(yīng)優(yōu)化研究。所得最佳制備工藝參數(shù)為：CHE·HCl/CMCS為20:1(g/g)，油相/水相為3.37:1(v/v)，CMCS濃度為2.30％，優(yōu)化后的載藥量為4.16％，包封率為57.4％。采用紅外光譜(IR)，掃描電鏡(SEM)，X射線衍射(X-Ray)和粒徑分析(D