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文檔簡介
1、目的:檢測女性盆腔器官脫垂(POP)患者子宮主韌帶和陰道前壁中鈣蛋白酶(calpain)、鈣蛋白酶抑制蛋白(calpastatin)的表達(dá),探討兩種蛋白表達(dá)變化與POP發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。
材料與方法:
一、材料
32例子宮脫垂患者的主韌帶、膨出陰道前壁全層組織及17例非脫垂患者的主韌帶及陰道前壁全層組織來自2007年10月到2009年10月間中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦科手術(shù)切除的組織。所有組織平均
2、分成兩份,一份經(jīng)福爾馬林固定,常規(guī)石蠟包埋,另一份放入1.5ml Eppendorf管中液氮保存。
二、主要試劑
免疫組化:calpain-2兔抗人單克隆抗體及calpastatin兔抗人單克隆抗體購自Santa公司,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑及S-P試劑盒購自北京中杉生物技術(shù)有限公司。
RT-PCR:Trizol試劑購自Invitrogen公司,PCR引物序列由上海生工生物公司合成,RT-P
3、CR試劑盒購自TAKARA公司,DL-2000 Marker購自大連寶生物工程公司。
三、方法
(一)免疫組織化學(xué)染色:按鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶(S-P)法行免疫組織化學(xué)染色。切片常規(guī)脫蠟至水,高溫高壓進(jìn)行抗原修復(fù),一抗4℃孵育過夜,DAB顯色,蘇木素復(fù)染。用PBS代替一抗作為陰性對照。結(jié)果判定:細(xì)胞漿內(nèi)見棕黃色顆粒為陽性表達(dá)。光鏡下在每張切片中隨機(jī)選取10個高倍視野,評分標(biāo)準(zhǔn):0,無陽性區(qū)域;1,陽
4、性區(qū)域面積1-20%;2,陽性區(qū)域面積20-50%;3,陽性區(qū)域面積>50%。0-1:為calpain-2或calpastatin陰性表達(dá);2-3: calpain-2或calpastatin陽性表達(dá)。
(二)RT-PCR
1、RNA的提取:從液氮中取出標(biāo)本,Trizol法提取總RNA(按100mg組織加1ml Trizol)。
2、RT反應(yīng):取已提取RNAlμl加入反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液里進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成
5、cDNA(反應(yīng)體系為10μl)。
3、PCR擴(kuò)增calpain-2引物:上游引物5′-AGC CAT TGC CTC CCT CAC-3′,下游引物5′-CCA CCC ACT CGC CGT ATT-3′;calpastatin引物:上游引物5′-ACC ATC TAA GCC AAC T-3′,下游引物5′-TTC ACG GTC TTC TTC T-3′;內(nèi)參照物采用β-肌動蛋白(β-actin),上游引物5’-GT
6、G GGG CGC CCC AGG CAC CA-3’,下游引物5'-CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3’。PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增程序按以下條件設(shè)定:94℃40s,退火30s,72℃1min,30個循環(huán)。β-actin、calpain-2及calpastatin退火溫度分別為55℃,55.5℃,56℃。所有基因擴(kuò)增前94℃預(yù)變性3min,擴(kuò)增后72℃延伸7min。
4、電泳: PCR產(chǎn)物各5μl
7、經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分離,紫外燈下觀察并拍照,進(jìn)行圖象分析。
四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件,calpain-2或calpastatin的蛋白表達(dá)和POP的關(guān)系用卡方檢驗(yàn);脫垂組及對照組之間calpain-2及calpastatin mRNA的比較用T檢驗(yàn),P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)果:
一、calpain-2或calpastatin蛋白在主韌帶及陰道前壁組
8、織中的表達(dá)情況
1、calpain-2陽性表達(dá)于細(xì)胞漿,在POP組患者主韌帶及陰道前壁組織calpain-2陽性表達(dá)水平分別為71.9%、78.1%。而在對照組陽性表達(dá)水平分別為23.5%、29.4%。二者有顯著性差異。
2、calpastatin亦表達(dá)于細(xì)胞漿,calpastatin的表達(dá)水平在脫垂組主韌帶及陰道前壁組織中的陽性表達(dá)率分別為25.0%、21.9%,低于對照組分別為58.8%、76.5%,統(tǒng)計(jì)
9、學(xué)分析兩組的差異有顯著性。
二、calpain-2及calpastatin mRNA在主韌帶及陰道前壁組織中的表達(dá)情況
通過RT-PCR發(fā)現(xiàn),calpain-2及calpastatin在主韌帶及陰道前壁組織中均有表達(dá)。在主韌帶及陰道前壁中,脫垂組calpain-2mRNA表達(dá)水平較對照組有升高趨勢,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。脫垂組calpastatin mRNA表達(dá)水平較對照組有降低趨勢,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
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