軟骨細(xì)胞中成纖維細(xì)胞生長因子對長鏈非編碼RNA Malat1的影響.pdf

1、骨骼是人類最大的器官。骨骼的生長發(fā)育是一個復(fù)雜的過程，其生長方式主要有兩種，即膜內(nèi)成骨與軟骨內(nèi)成骨。其中軟骨內(nèi)成骨是軀干骨，四肢長骨，以及部分不規(guī)則短骨生長的主要方式，膜內(nèi)成骨則是頂骨，額骨和鎖骨等骨骼的主要形成方式。軟骨內(nèi)成骨在胚胎發(fā)育過程及長骨形成等方面發(fā)揮重要的作用，目前公認(rèn)成纖維細(xì)胞生長因子（Fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）信號通路在軟骨內(nèi)成骨過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。
　　成纖維細(xì)胞生長因子家

2、族由22個成員組成，目前認(rèn)為FGF2是其中表達(dá)最廣泛的細(xì)胞因子。成纖維細(xì)胞生長因子通過與細(xì)胞膜上的成纖維細(xì)胞生長因子受體(Fibroblast growth factor receptor，F(xiàn)GFR)激活下游多種通路，產(chǎn)生一系列效應(yīng)。在小鼠模型及人類病例中，F(xiàn)GFR點突變能引起多種類型的侏儒。在軟骨細(xì)胞中，F(xiàn)GF信號通路能抑制細(xì)胞增殖。目前關(guān)于FGF信號通路所影響的下游蛋白分子已有很多研究，但在軟骨組織中FGF信號通路是否通過影響非編碼

3、蛋白RNA從而發(fā)揮其對軟骨細(xì)胞的調(diào)控作用，尚沒有得到很好的研究。
　　近年來對非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)在胚胎發(fā)育，正常生理過程及疾病過程中的作用認(rèn)識日益加深。非編碼RNA不編碼成蛋白質(zhì)，以其它方式發(fā)揮作用。長鏈非編碼RNAs(Long non-coding RNAs)是指轉(zhuǎn)錄長度超過200個堿基對的ncRNA，在物種間保守性不高，通過多種途徑調(diào)控基因的表達(dá)。Malat1是一個在哺乳動物中高度保守存在

4、的LncRNA，最初在關(guān)于非小細(xì)胞肺癌的篩選性研究中被發(fā)現(xiàn)。之后發(fā)現(xiàn)幾乎所有的腫瘤細(xì)胞中Malat1均有高表達(dá)，大量腫瘤學(xué)研究表明Malat1對多種腫瘤細(xì)胞具有促侵襲和促轉(zhuǎn)移作用。Malat1在成骨細(xì)胞增殖，骨肉瘤增殖侵襲等方面具有促進作用，這些研究表明在骨骼中，Malat1可能發(fā)揮一定的作用，但其在軟骨細(xì)胞中有無作用尚不清楚，在軟骨發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用的FGF信號是否與Malat1有聯(lián)系目前也不清楚。
　　目的:
　　本

5、實驗室在FGF信號通路對軟骨的調(diào)控方面做了很多研究，積累了良好的基礎(chǔ)。關(guān)于FGF信號通路所影響的下游蛋白分子已有很多研究，但在軟骨組織中FGF信號通路是否通過影響非蛋白類分子，比如LncRNAs，從而發(fā)揮其對軟骨細(xì)胞的調(diào)控作用，尚不十分清楚。
　　因此我們首先以小鼠原代軟骨細(xì)胞，小鼠軟骨前體細(xì)胞系A(chǔ)TDC5，人類正常軟骨細(xì)胞C28I2作為細(xì)胞模型，檢測了Malat1在軟骨細(xì)胞中的基礎(chǔ)表達(dá)水平，我們的結(jié)果表明Malat1在小鼠和人的

6、軟骨細(xì)胞中均呈現(xiàn)高豐度表達(dá)，這樣高的基礎(chǔ)水平提示Malat1在軟骨細(xì)胞中可能發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能。因此在本課題中，我們利用小片段干擾RNA技術(shù)干擾了Malat1的表達(dá)水平，初步研究Malat1對軟骨細(xì)胞的作用。為了探究FGF信號通路是否調(diào)控Malat1的表達(dá)，我們進一步利用重組FGF2結(jié)合相關(guān)通路阻斷劑處理小鼠原代軟骨細(xì)胞，小鼠及人類軟骨細(xì)胞系模型，探討了FGF2信號通路是否可以通過調(diào)控Malat1的表達(dá)調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖。
　　

7、方法:
　　1.Malat1在軟骨細(xì)胞中的基礎(chǔ)表達(dá)水平
　　1.1分離C57小鼠新生幼崽（日齡3～5日）原代軟骨，接種培養(yǎng)48h后提取RNA，利用qPCR檢測Malat1的表達(dá)水平。
　　1.2培養(yǎng)小鼠成纖維細(xì)胞系NIH3T3，小鼠軟骨前體細(xì)胞系A(chǔ)TDC5，人正常軟骨細(xì)胞系C28I2，以及人骨肉瘤細(xì)胞系SW1353，24h及48h后提取RNA并檢測Malat1的表達(dá)水平。
　　2.Malat1對ATDC5軟骨細(xì)胞

8、系增殖的影響
　　2.1設(shè)計數(shù)條針對小鼠Malat1基因的siRNA并通過熒光指示劑和qPCR篩選出最有效的siRNA。
　　2.2將siRNA轉(zhuǎn)染至ATDC5細(xì)胞并通過細(xì)胞計數(shù)研究Malat1敲減對ATDC5細(xì)胞增殖速度的影響。
　　3.FGF2對軟骨細(xì)胞中Malat1表達(dá)水平的影響
　　3.1用FGF2處理C57小鼠原代軟骨細(xì)胞，及ATDC5細(xì)胞，在處理后不同時間點提取RNA，qPCR測定Malat1的表達(dá)水

9、平，以未處理組作為對照組。
　　3.2用ERK通路抑制劑U0126單獨或與FGF2共同處理ATDC5細(xì)胞，在處理后24h收取RNA，qPCR檢測Malat1的表達(dá)水平，以未處理組作為對照組。
　　3.3從本科室保育的β-catenin小鼠中分離原代軟骨細(xì)胞并培養(yǎng)，48h后收取細(xì)胞并提取RNA，qPCR檢測Malat1表達(dá)水平的變化，以未敲除組作為對照組。
　　3.4從本科室保育的FGFR1Co12陽性細(xì)胞特異性敲除小鼠

10、及FGFR3系統(tǒng)性敲除小鼠中分離原代軟骨細(xì)胞并培養(yǎng)，48h后收取細(xì)胞并提取RNA，qPCR檢測Malat1表達(dá)水平的變化，以同窩未敲除幼崽作為對照組。
　　3.5設(shè)計針對Fgfr1的siRNA，并構(gòu)建和制備Myc-Fgfr1質(zhì)粒，確認(rèn)其工作效率后將兩者轉(zhuǎn)入ATDC5細(xì)胞，24h后利用qPCR技術(shù)檢測Malat1表達(dá)水平的變化，以未處理組作為對照組。
　　結(jié)果:
　　1.Malat1在多種軟骨細(xì)胞系中的表達(dá)豐度。

11、　　我們首先利用qPCR檢測了NIH3T3細(xì)胞中Malat1的基礎(chǔ)表達(dá)水平，以其作為參照，結(jié)果提示Malat1在C57小鼠原代軟骨細(xì)胞，小鼠軟骨細(xì)胞系A(chǔ)TDC5，人正常軟骨細(xì)胞系C28I2及人骨肉瘤細(xì)胞系SW1353中均為高豐度基礎(chǔ)表達(dá)。在ATDC5細(xì)胞中，24h及48h時間點Malat1的基礎(chǔ)表達(dá)水平無明顯差異。
　　2.敲減Malat1對ATDC5細(xì)胞的增殖速度的影響。
　　用si-Malat1轉(zhuǎn)染細(xì)胞，觀察共轉(zhuǎn)染的熒光

12、指示劑，結(jié)果提示si-Malat1已經(jīng)被成功轉(zhuǎn)染到ATDC5細(xì)胞中;收取細(xì)胞RNA，利用qPCR檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Malat1的表達(dá)水平被成功干擾，干擾效率超過50％;si-Malat1轉(zhuǎn)染細(xì)胞后多個時間點進行細(xì)胞計數(shù)，以未處理組作為對照組，結(jié)果表明Malat1被干擾后，ATDC5細(xì)胞的增殖速度出現(xiàn)了明顯下降。
　　3.FGF信號對Malat1的調(diào)控。
　　用FGF2處理C57小鼠原代軟骨細(xì)胞，小鼠軟骨細(xì)胞系A(chǔ)TDC5，人正常軟

13、骨細(xì)胞系C28I2及人骨肉瘤細(xì)胞系SW1353，24h后收取細(xì)胞提取RNA，進行qPCR檢測。以未處理組作為對照組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在上述細(xì)胞中，F(xiàn)GF2處理均明顯抑制了Malat1的表達(dá)水平。在ATDC5細(xì)胞中進行多濃度和多時間點FGF2處理，提取RNA后qPCR檢測，結(jié)果提示FGF2對ATDC5細(xì)胞中Malat1的抑制作用無劑量依賴效應(yīng)，在24h即已生效，持續(xù)時間可達(dá)24小時以上。
　　利用本科室保育的β-catenin Co12陽性

14、細(xì)胞特異性敲除小鼠幼仔分離原代軟骨細(xì)胞培養(yǎng)，利用qPCR檢測Malat1的表達(dá)水平，以未敲除組作為對照組，發(fā)現(xiàn)Malat1的表達(dá)水平未發(fā)生明顯變化。
　　利用ERK信號通路抑制劑U0126單獨處理或與FGF2共同處理ATDC5細(xì)胞，收取RNA進行qPCR檢測，結(jié)果表明ATDC5細(xì)胞經(jīng)U0126處理后，Malat1的表達(dá)水平顯著提高，且FGF2與U0126共同處理時，F(xiàn)GF2不能抑制Malat1的表達(dá)水平。提示FGF2對Malat1

15、的抑制可能是通過FGF受體激活下游ERK通路完成的。
　　利用本科室保育的FGFR1條件性敲除小鼠及FGFR3敲除小鼠幼仔分離原代軟骨細(xì)胞培養(yǎng)，利用qPCR檢測Malat1的表達(dá)水平，以未敲除組作為對照組，發(fā)現(xiàn)在FGFR3敲除小鼠原代軟骨中，Malat1的基礎(chǔ)表達(dá)水平未發(fā)生明顯變化，同時，F(xiàn)gfr3敲除的小鼠幼仔原代軟骨經(jīng)FGF2處理后，Malat1的表達(dá)仍然是下調(diào)的;在FGFR1條件性敲除小鼠的原代軟骨中，Malat1的基礎(chǔ)表達(dá)

16、水平顯著上升，并且在條件性敲除Fgfr1的小鼠原代軟骨中，與對照組相比，F(xiàn)GF2處理不能再抑制Malat1的表達(dá)。與此同時，我們設(shè)計了針對Fgfr1的siRNA，并構(gòu)建制備了Myc-Fgfr1質(zhì)粒，將siRNA及Fgfr1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入ATDC5細(xì)胞中，24h后收取RNA進行qPCR檢測，結(jié)果提示Fgfr1表達(dá)水平被干擾后，Malat1的表達(dá)水平明顯增高，同時，與FGF2處理的空白對照組相比，F(xiàn)gfr1被干擾后FGF2不能有效地抑制Mal