BDNF轉染神經干細胞治療視神經損傷的實驗研究.pdf

1、視神經損傷后的修復再生是神經科學領域的前沿熱點。非離斷性急慢性視神經損傷在臨床較為常見，但目前治療（視神經減壓或藥物）效果尚不理想。如何最大限度地修復患者損傷的視神經，以期達到功能重建，提高患者的生存質量，對恢復患者正常的工作、生活有重要的意義。 近年來，基于神經干細胞（neural stem cells,NSCs）的中樞神經系統(tǒng)損傷修復技術引起國內外學者的普遍重視。NSCs具有自我更新和多向分化的特性，已開始應用于腦損傷治療。

2、但神經干細胞增殖分化的機制較為復雜，神經營養(yǎng)素家族的一些因子可以通過與NSCs表面受體結合，調控其生物學性狀。神經干細胞移植后由于局部微環(huán)境的影響，分化為神經元的比例較低，所以單純NSCs移植面臨較大的困難。免疫熒光染色研究發(fā)現80％的神經干細胞表達腦源性神經營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）受體，提示BDNF可能在調節(jié)干細胞源性神經元分化中起重要作用。進一步的研究證實，BDNF可以

3、誘導神經干細胞向神經元表型分化，將BDNF注入側腦室后，發(fā)現在特定腦區(qū)新生細胞數量明顯增加，并且表達神經元特異標志物。然而，單純注射BDNF后體內作用時間短暫，反復注射又易增加損傷及感染風險。 本研究擬利用慢病毒作載體，構建hBDNF（目的基因）和GFP（報告基因）共表達的慢病毒載體，通過轉染神經干細胞，將共表達基因hBDNF-GFP轉入神經干細胞染色體中，構建成既能表達hBDNF又能表達GFP的神經干細胞。再將轉染后的細胞移植

4、到視神經損傷模型眼內，探求治療視神經損傷的新途徑。 實驗目的： 探討hBDNF-GFP基因轉染NSCs在大鼠視神經損傷修復中的作用。 實驗方法： 1.取胎鼠海馬組織，分離神經干細胞，傳代培養(yǎng)，Nestin蛋白鑒定。 2.構建慢病毒載體，將hBDNF基因及報告基因GFP轉染所培養(yǎng)的神經干細胞。經傳代后，RT-PCR檢測hBDNF mRNA表達，ELISA法檢測細胞蛋白表達，并進行蛋白活性檢測。

5、 3.使用顯微神經外科技術，建立成年大鼠視神經部分損傷模型，將轉染hBDNF基因的神經干細胞移植于視神經損傷側眼內。 4.采用免疫組化方法，觀察移植細胞體內遷移、分化及視網膜神經節(jié)細胞存活情況。 5.采用ELISA、Western-blot等技術分析hBDNF體內表達情況。 實驗結果： 1．通過機械吹打和懸浮培養(yǎng)法成功從胎鼠海馬區(qū)域獲得神經干細胞，體外活性良好，可分化為神經元和膠質細胞；體外

6、連續(xù)傳代3次后絕大部分細胞Nestin表達陽性。 2．利用慢病毒介導GFP-hBDNF共表達基因成功轉染NSCs，轉染后的神經干細胞可以表達和分泌有生物學活性的hBDNF和GFP。 3．成功建立了大鼠視神經部分損傷模型。 4．將經慢病毒載體轉染后的神經干細胞（hBDNF-GFP-NSCs）移植到視神經損傷大鼠玻璃體腔14d，28d后，用ELISA法檢測發(fā)現，大鼠視網膜中hBDNF表達量較對照組明顯增加；移植

7、4周和8周后Western-blot印跡法檢測發(fā)現，受損視網膜中hBDNF表達同樣高于對照組。 5．免疫組織化學法染色研究觀察，移植的GFP-NSCs和hBDNF-GFP-NSCs體內均能遷移到受損視網膜深層，并可以分化為神經元（β-tubulin表達陽性）和膠質細胞（GFAP陽性表達），有少量分化為視網膜神經節(jié)細胞樣細胞（Thy1.1陽性）。 6．視網膜鋪片行免疫標記后計數視網膜節(jié)細胞數目，結果發(fā)現移植hBDNF-