BDNF轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞治療視神經(jīng)損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、視神經(jīng)損傷后的修復(fù)再生是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的前沿?zé)狳c(diǎn)。非離斷性急慢性視神經(jīng)損傷在臨床較為常見(jiàn)，但目前治療（視神經(jīng)減壓或藥物）效果尚不理想。如何最大限度地修復(fù)患者損傷的視神經(jīng)，以期達(dá)到功能重建，提高患者的生存質(zhì)量，對(duì)恢復(fù)患者正常的工作、生活有重要的意義。 近年來(lái)，基于神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells,NSCs）的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)技術(shù)引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的普遍重視。NSCs具有自我更新和多向分化的特性，已開(kāi)始應(yīng)用于腦損傷治療。

2、但神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的機(jī)制較為復(fù)雜，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素家族的一些因子可以通過(guò)與NSCs表面受體結(jié)合，調(diào)控其生物學(xué)性狀。神經(jīng)干細(xì)胞移植后由于局部微環(huán)境的影響，分化為神經(jīng)元的比例較低，所以單純NSCs移植面臨較大的困難。免疫熒光染色研究發(fā)現(xiàn)80％的神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）受體，提示BDNF可能在調(diào)節(jié)干細(xì)胞源性神經(jīng)元分化中起重要作用。進(jìn)一步的研究證實(shí)，BDNF可以

3、誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元表型分化，將BDNF注入側(cè)腦室后，發(fā)現(xiàn)在特定腦區(qū)新生細(xì)胞數(shù)量明顯增加，并且表達(dá)神經(jīng)元特異標(biāo)志物。然而，單純注射BDNF后體內(nèi)作用時(shí)間短暫，反復(fù)注射又易增加損傷及感染風(fēng)險(xiǎn)。 本研究擬利用慢病毒作載體，構(gòu)建hBDNF（目的基因）和GFP（報(bào)告基因）共表達(dá)的慢病毒載體，通過(guò)轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞，將共表達(dá)基因hBDNF-GFP轉(zhuǎn)入神經(jīng)干細(xì)胞染色體中，構(gòu)建成既能表達(dá)hBDNF又能表達(dá)GFP的神經(jīng)干細(xì)胞。再將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞移植

4、到視神經(jīng)損傷模型眼內(nèi)，探求治療視神經(jīng)損傷的新途徑。 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?探討hBDNF-GFP基因轉(zhuǎn)染NSCs在大鼠視神經(jīng)損傷修復(fù)中的作用。 實(shí)驗(yàn)方法： 1.取胎鼠海馬組織，分離神經(jīng)干細(xì)胞，傳代培養(yǎng)，Nestin蛋白鑒定。 2.構(gòu)建慢病毒載體，將hBDNF基因及報(bào)告基因GFP轉(zhuǎn)染所培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞。經(jīng)傳代后，RT-PCR檢測(cè)hBDNF mRNA表達(dá)，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞蛋白表達(dá)，并進(jìn)行蛋白活性檢測(cè)。

5、 3.使用顯微神經(jīng)外科技術(shù)，建立成年大鼠視神經(jīng)部分損傷模型，將轉(zhuǎn)染hBDNF基因的神經(jīng)干細(xì)胞移植于視神經(jīng)損傷側(cè)眼內(nèi)。 4.采用免疫組化方法，觀察移植細(xì)胞體內(nèi)遷移、分化及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活情況。 5.采用ELISA、Western-blot等技術(shù)分析hBDNF體內(nèi)表達(dá)情況。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1．通過(guò)機(jī)械吹打和懸浮培養(yǎng)法成功從胎鼠海馬區(qū)域獲得神經(jīng)干細(xì)胞，體外活性良好，可分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞；體外

6、連續(xù)傳代3次后絕大部分細(xì)胞Nestin表達(dá)陽(yáng)性。 2．利用慢病毒介導(dǎo)GFP-hBDNF共表達(dá)基因成功轉(zhuǎn)染NSCs，轉(zhuǎn)染后的神經(jīng)干細(xì)胞可以表達(dá)和分泌有生物學(xué)活性的hBDNF和GFP。 3．成功建立了大鼠視神經(jīng)部分損傷模型。 4．將經(jīng)慢病毒載體轉(zhuǎn)染后的神經(jīng)干細(xì)胞（hBDNF-GFP-NSCs）移植到視神經(jīng)損傷大鼠玻璃體腔14d，28d后，用ELISA法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，大鼠視網(wǎng)膜中hBDNF表達(dá)量較對(duì)照組明顯增加；移植

7、4周和8周后Western-blot印跡法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，受損視網(wǎng)膜中hBDNF表達(dá)同樣高于對(duì)照組。 5．免疫組織化學(xué)法染色研究觀察，移植的GFP-NSCs和hBDNF-GFP-NSCs體內(nèi)均能遷移到受損視網(wǎng)膜深層，并可以分化為神經(jīng)元（β-tubulin表達(dá)陽(yáng)性）和膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP陽(yáng)性表達(dá)），有少量分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞樣細(xì)胞（Thy1.1陽(yáng)性）。 6．視網(wǎng)膜鋪片行免疫標(biāo)記后計(jì)數(shù)視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞數(shù)目，結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植hBDNF-