移植神經(jīng)或bFGF轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細胞對受損視神經(jīng)細胞增殖的作用及機制.pdf

1、目的：視神經(jīng)損傷后雖然有再生的潛力,但由于整個微環(huán)境不支持神經(jīng)再生,所以到目前為止因視神經(jīng)損傷或疾病造成的失明還沒有較好的治療方法。特別是視神經(jīng)損傷后,神經(jīng)中的細胞數(shù)量逐漸減少,最終致視神經(jīng)萎縮,更不利于再生軸突的生長和髓鞘化。為此,本研究從促進視神經(jīng)損傷后細胞增殖和抑制細胞凋亡的角度,移植自體腓總神經(jīng)或人堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)基因轉(zhuǎn)染的大鼠毛囊神經(jīng)干細胞,修復(fù)大鼠受損視神經(jīng),研究視神經(jīng)細胞的增殖、凋亡、相關(guān)蛋白和基因表達及

2、神經(jīng)再生的變化,探討修復(fù)視神經(jīng)損傷的方法及相關(guān)機制,為臨床上治療視神經(jīng)損傷提供實驗依據(jù)。 方法：(1)實驗分組及動物模型制備：成年雄性SD大鼠,體重150～180 g。正常對照組：未手術(shù)側(cè)視神經(jīng)作正常對照組。損傷組：于眼球后2mm處將微電極玻璃管刺入視神經(jīng),完全吸除一段長約0.5 mm的神經(jīng),致視神經(jīng)完全斷開,但視神經(jīng)外膜和血管保持完整。神經(jīng)(預(yù)變性自體腓總神經(jīng))移植組：用顯微外科鑷壓榨腓總神經(jīng)近端,術(shù)后14 d取出,用顯微外科

3、縫合技術(shù)將其一端縫接到視神經(jīng)吸斷處,另一端游離于皮下?？瞻踪|(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞移植組：在損傷組的基礎(chǔ)上,于視神經(jīng)吸斷處注入1.5μl空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染毛囊神經(jīng)干細胞懸液(約4～8×104細胞)。bFGF轉(zhuǎn)染細胞移植組：在損傷組的基礎(chǔ)上,于視神經(jīng)吸斷處注入1.5μl bFGF轉(zhuǎn)基因毛囊神經(jīng)干細胞懸液(約4～8×104細胞)。(2)H-E染色：動物術(shù)后3、7、14 d和28 d,經(jīng)心灌注固定,取眶內(nèi)段視神經(jīng),H-E染色,計數(shù)細胞數(shù)量。(3)免疫印跡檢測：

4、動物術(shù)后7d,行頸椎脫臼致死,取正常大鼠兩側(cè)以及損傷組、神經(jīng)移植組術(shù)側(cè)眶內(nèi)段神經(jīng),抽總蛋白作細胞增殖性核抗原(PCNA)免疫印跡檢測。(4)流式細胞儀檢測：術(shù)后7 d,取正常大鼠兩側(cè)以及損傷組、神經(jīng)移植組術(shù)側(cè)眶內(nèi)段視神經(jīng),PBS漂洗,用解剖刀剔除脂肪和壞死細胞,將視神經(jīng)組織剪碎,0.25％Trypsin-EDTA消化,吹打,過濾制成細胞懸液,然后用75％酒精固定,4℃保存作流式細胞儀檢測細胞周期。(5)基因芯片檢測：術(shù)后7 d,取正常大

5、鼠兩側(cè)以及損傷組、神經(jīng)移植組術(shù)側(cè)眶內(nèi)段視神經(jīng),用Agilent大鼠oligo芯片(產(chǎn)品目錄號G4130A)檢測視神經(jīng)的基因表達情況。(6)質(zhì)粒構(gòu)建：用酶切、連接方法在體外構(gòu)建質(zhì)粒載體PDsRed2-N1-bFGF。(7)毛囊神經(jīng)干細胞培養(yǎng)：取雄性SD大鼠(體重80～100g)的觸須墊,顯微鏡下剝離毛囊隆突區(qū),進行毛囊神經(jīng)干細胞貼塊培養(yǎng),傳代細胞進行GFAP、β-tubulin Ⅲ免疫熒光細胞化學(xué)鑒定。(8)毛囊神經(jīng)干細胞bFGF轉(zhuǎn)染及移

6、植：經(jīng)脂質(zhì)體將基因載體PDsRed2-N1-bFGF穩(wěn)定轉(zhuǎn)染毛囊神經(jīng)干細胞,取轉(zhuǎn)染后篩選細胞作神經(jīng)干細胞表面標(biāo)志分子Nestin和bFGF免疫細胞化學(xué)檢測以鑒定細胞狀態(tài)和蛋白表達情況,然后進行大鼠受損視神經(jīng)細胞移植(約4～8×104細胞)。細胞移植術(shù)后7 d、14 d,取術(shù)側(cè)眶內(nèi)段視神經(jīng)作冰凍切片,熒光顯微鏡下觀察表達紅色熒光蛋白RFP移植細胞的存活、遷移情況。(9)免疫組織化學(xué)檢測：細胞移植后7 d、14 d,經(jīng)心灌注固定,取眶內(nèi)段視

7、神經(jīng),石蠟包埋、切片,免疫組織化學(xué)檢測視神經(jīng)中巢蛋白(Nestin)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、神經(jīng)纖維絲(NF)等分子的表達情況,結(jié)合Biosens Digital Imaging System計算機圖像處理系統(tǒng)(Shanghai Bio-tec)進行圖像分析。 結(jié)果：(1)H-E染色：視神經(jīng)傷區(qū)及其附近區(qū)域,傷后3、7 d多為滲出的炎性細胞,傷后14、28 d以成纖維細胞和炎性細胞為主呈增生狀態(tài)；近側(cè)段神經(jīng)纖維疏松、水腫

8、而變得粗大；遠側(cè)段中這種反應(yīng)較弱,神經(jīng)纖維致密,細胞核的排列基本與神經(jīng)纖維束平行,有少量的炎性細胞。損傷組、神經(jīng)移植組和bFGF轉(zhuǎn)染細胞移植組視神經(jīng)遠側(cè)段中,細胞密度以傷后7 d時最高；神經(jīng)移植組和bFGF轉(zhuǎn)染細胞移植組中的細胞密度均顯著高于損傷組,其中bFGF轉(zhuǎn)染細胞移植組細胞密度最高。(2)免疫印跡檢測顯示,與正常對照組相比,損傷組PCNA的表達量明顯下調(diào),而神經(jīng)移植組的表達量相對損傷組又明顯上調(diào)。(3)流式細胞儀檢測結(jié)果顯示,損傷

9、組凋亡細胞所占比例(39.1％)與正常對照組(6.3％)相比明顯上升,損傷組增殖指數(shù)(15.40％)與正常組相比(34.3％)也顯著下調(diào)。神經(jīng)移植組凋亡細胞比例(18.3％)較正常對照組明顯增加,但較損傷組明顯減少；神經(jīng)移植組增殖指數(shù)(36.8％)與正常對照組相近,但較損傷組明顯增加。(4)基因表達譜：以Ratio≥2或Ratio≤0.5為差異表達基因篩選標(biāo)準(zhǔn),對差異表達基因進行功能聚類分析,共分為17類。與正常對照組相比,損傷組促進細

10、胞增殖的基因有6條上調(diào)、2條下調(diào),抑制細胞增殖的基因4條上調(diào)、1條下調(diào)；抗細胞凋亡基因有6條上調(diào)、1條下調(diào),促細胞凋亡基因有6條上調(diào)、2條下調(diào)。與損傷組相比,神經(jīng)移植組促進細胞增殖的基因有2條上調(diào)、2條下調(diào),抑制細胞增殖的基因沒有上調(diào)、只有1條下調(diào)；抗細胞凋亡基因和促細胞凋亡基因分別有1條上調(diào),沒有下調(diào)。(5)毛囊神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)及鑒定：原代培養(yǎng)的毛囊神經(jīng)干細胞,細胞從毛囊隆突區(qū)遷出并增殖,傳代后無血清培養(yǎng)14 d,免疫熒光細胞化學(xué)檢測

11、可鑒定為Nestin陽性的神經(jīng)干細胞；傳代細胞經(jīng)血清誘導(dǎo)14 d后,免疫熒光細胞化學(xué)檢測顯示可誘導(dǎo)為GFAP陽性的星形膠質(zhì)細胞和β-tubulin Ⅲ陽性的神經(jīng)元。(6)轉(zhuǎn)染bFGF毛囊神經(jīng)干細胞經(jīng)G418篩選8 d后,免疫熒光細胞化學(xué)檢測該細胞呈Nestin陽性,bFGF在細胞質(zhì)內(nèi)表達。(7)轉(zhuǎn)染bFGF毛囊神經(jīng)干細胞移植入大鼠受損視神經(jīng)中,在術(shù)后7d、14d仍能存活,并向視神經(jīng)損傷區(qū)遠側(cè)段遷移,注入相同細胞數(shù)量時,鏡下可見在7 d存

12、活細胞數(shù)比14 d時多,但14 d時細胞向遠側(cè)端遷移的更遠。(8)免疫組織化學(xué)染色：與損傷組相比,空白質(zhì)粒組和細胞移植組視神經(jīng)遠側(cè)段的Nestin、MBP、NF陽性物質(zhì)均有上升趨勢,GFAP則逐漸減少；與空白質(zhì)粒組相比,細胞移植組視神經(jīng)遠側(cè)段的Nestin、NF陽性物質(zhì)均增多,只有GFAP陽性區(qū)的面積稍有下降。 結(jié)論：視神經(jīng)損傷后,經(jīng)移植自體預(yù)變性腓總神經(jīng),視神經(jīng)的細胞數(shù)量增加,細胞增殖指數(shù)上升,凋亡細胞比例減少,PCNA的表達

13、量上調(diào),凋亡、增殖相關(guān)的基因表達發(fā)生變化,整個視神經(jīng)微環(huán)境有利于受損視神經(jīng)再生修復(fù)。特別是在移植了PDsRed2-N1-bFGF轉(zhuǎn)染毛囊神經(jīng)干細胞后,相對于空白質(zhì)粒移植組,細胞數(shù)量增加明顯,神經(jīng)膠質(zhì)細胞排列緊密,促進神經(jīng)生長相關(guān)蛋白表達增加,有利于受損視神經(jīng)再生。結(jié)果證實了移植預(yù)變性自體腓總神經(jīng)或轉(zhuǎn)染bFGF毛囊神經(jīng)干細胞,能增加受損視神經(jīng)的細胞數(shù)量,抑制細胞凋亡,改善視神經(jīng)再生微環(huán)境,改變了一些相關(guān)的基因表達,促進了受損神經(jīng)的再生修復(fù)