移植神經(jīng)或bFGF轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)受損視神經(jīng)細(xì)胞增殖的作用及機(jī)制.pdf

1、目的：視神經(jīng)損傷后雖然有再生的潛力,但由于整個(gè)微環(huán)境不支持神經(jīng)再生,所以到目前為止因視神經(jīng)損傷或疾病造成的失明還沒(méi)有較好的治療方法。特別是視神經(jīng)損傷后,神經(jīng)中的細(xì)胞數(shù)量逐漸減少,最終致視神經(jīng)萎縮,更不利于再生軸突的生長(zhǎng)和髓鞘化。為此,本研究從促進(jìn)視神經(jīng)損傷后細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡的角度,移植自體腓總神經(jīng)或人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)基因轉(zhuǎn)染的大鼠毛囊神經(jīng)干細(xì)胞,修復(fù)大鼠受損視神經(jīng),研究視神經(jīng)細(xì)胞的增殖、凋亡、相關(guān)蛋白和基因表達(dá)及

2、神經(jīng)再生的變化,探討修復(fù)視神經(jīng)損傷的方法及相關(guān)機(jī)制,為臨床上治療視神經(jīng)損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：(1)實(shí)驗(yàn)分組及動(dòng)物模型制備：成年雄性SD大鼠,體重150～180 g。正常對(duì)照組：未手術(shù)側(cè)視神經(jīng)作正常對(duì)照組。損傷組：于眼球后2mm處將微電極玻璃管刺入視神經(jīng),完全吸除一段長(zhǎng)約0.5 mm的神經(jīng),致視神經(jīng)完全斷開(kāi),但視神經(jīng)外膜和血管保持完整。神經(jīng)(預(yù)變性自體腓總神經(jīng))移植組：用顯微外科鑷壓榨腓總神經(jīng)近端,術(shù)后14 d取出,用顯微外科

3、縫合技術(shù)將其一端縫接到視神經(jīng)吸斷處,另一端游離于皮下?？瞻踪|(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞移植組：在損傷組的基礎(chǔ)上,于視神經(jīng)吸斷處注入1.5μl空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染毛囊神經(jīng)干細(xì)胞懸液(約4～8×104細(xì)胞)。bFGF轉(zhuǎn)染細(xì)胞移植組：在損傷組的基礎(chǔ)上,于視神經(jīng)吸斷處注入1.5μl bFGF轉(zhuǎn)基因毛囊神經(jīng)干細(xì)胞懸液(約4～8×104細(xì)胞)。(2)H-E染色：動(dòng)物術(shù)后3、7、14 d和28 d,經(jīng)心灌注固定,取眶內(nèi)段視神經(jīng),H-E染色,計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量。(3)免疫印跡檢測(cè)：

4、動(dòng)物術(shù)后7d,行頸椎脫臼致死,取正常大鼠兩側(cè)以及損傷組、神經(jīng)移植組術(shù)側(cè)眶內(nèi)段神經(jīng),抽總蛋白作細(xì)胞增殖性核抗原(PCNA)免疫印跡檢測(cè)。(4)流式細(xì)胞儀檢測(cè)：術(shù)后7 d,取正常大鼠兩側(cè)以及損傷組、神經(jīng)移植組術(shù)側(cè)眶內(nèi)段視神經(jīng),PBS漂洗,用解剖刀剔除脂肪和壞死細(xì)胞,將視神經(jīng)組織剪碎,0.25％Trypsin-EDTA消化,吹打,過(guò)濾制成細(xì)胞懸液,然后用75％酒精固定,4℃保存作流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。(5)基因芯片檢測(cè)：術(shù)后7 d,取正常大

5、鼠兩側(cè)以及損傷組、神經(jīng)移植組術(shù)側(cè)眶內(nèi)段視神經(jīng),用Agilent大鼠oligo芯片(產(chǎn)品目錄號(hào)G4130A)檢測(cè)視神經(jīng)的基因表達(dá)情況。(6)質(zhì)粒構(gòu)建：用酶切、連接方法在體外構(gòu)建質(zhì)粒載體PDsRed2-N1-bFGF。(7)毛囊神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)：取雄性SD大鼠(體重80～100g)的觸須墊,顯微鏡下剝離毛囊隆突區(qū),進(jìn)行毛囊神經(jīng)干細(xì)胞貼塊培養(yǎng),傳代細(xì)胞進(jìn)行GFAP、β-tubulin Ⅲ免疫熒光細(xì)胞化學(xué)鑒定。(8)毛囊神經(jīng)干細(xì)胞bFGF轉(zhuǎn)染及移

6、植：經(jīng)脂質(zhì)體將基因載體PDsRed2-N1-bFGF穩(wěn)定轉(zhuǎn)染毛囊神經(jīng)干細(xì)胞,取轉(zhuǎn)染后篩選細(xì)胞作神經(jīng)干細(xì)胞表面標(biāo)志分子Nestin和bFGF免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)以鑒定細(xì)胞狀態(tài)和蛋白表達(dá)情況,然后進(jìn)行大鼠受損視神經(jīng)細(xì)胞移植(約4～8×104細(xì)胞)。細(xì)胞移植術(shù)后7 d、14 d,取術(shù)側(cè)眶內(nèi)段視神經(jīng)作冰凍切片,熒光顯微鏡下觀察表達(dá)紅色熒光蛋白R(shí)FP移植細(xì)胞的存活、遷移情況。(9)免疫組織化學(xué)檢測(cè)：細(xì)胞移植后7 d、14 d,經(jīng)心灌注固定,取眶內(nèi)段視

7、神經(jīng),石蠟包埋、切片,免疫組織化學(xué)檢測(cè)視神經(jīng)中巢蛋白(Nestin)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、神經(jīng)纖維絲(NF)等分子的表達(dá)情況,結(jié)合Biosens Digital Imaging System計(jì)算機(jī)圖像處理系統(tǒng)(Shanghai Bio-tec)進(jìn)行圖像分析。 結(jié)果：(1)H-E染色：視神經(jīng)傷區(qū)及其附近區(qū)域,傷后3、7 d多為滲出的炎性細(xì)胞,傷后14、28 d以成纖維細(xì)胞和炎性細(xì)胞為主呈增生狀態(tài)；近側(cè)段神經(jīng)纖維疏松、水腫

8、而變得粗大；遠(yuǎn)側(cè)段中這種反應(yīng)較弱,神經(jīng)纖維致密,細(xì)胞核的排列基本與神經(jīng)纖維束平行,有少量的炎性細(xì)胞。損傷組、神經(jīng)移植組和bFGF轉(zhuǎn)染細(xì)胞移植組視神經(jīng)遠(yuǎn)側(cè)段中,細(xì)胞密度以傷后7 d時(shí)最高；神經(jīng)移植組和bFGF轉(zhuǎn)染細(xì)胞移植組中的細(xì)胞密度均顯著高于損傷組,其中bFGF轉(zhuǎn)染細(xì)胞移植組細(xì)胞密度最高。(2)免疫印跡檢測(cè)顯示,與正常對(duì)照組相比,損傷組PCNA的表達(dá)量明顯下調(diào),而神經(jīng)移植組的表達(dá)量相對(duì)損傷組又明顯上調(diào)。(3)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示,損傷

9、組凋亡細(xì)胞所占比例(39.1％)與正常對(duì)照組(6.3％)相比明顯上升,損傷組增殖指數(shù)(15.40％)與正常組相比(34.3％)也顯著下調(diào)。神經(jīng)移植組凋亡細(xì)胞比例(18.3％)較正常對(duì)照組明顯增加,但較損傷組明顯減少；神經(jīng)移植組增殖指數(shù)(36.8％)與正常對(duì)照組相近,但較損傷組明顯增加。(4)基因表達(dá)譜：以Ratio≥2或Ratio≤0.5為差異表達(dá)基因篩選標(biāo)準(zhǔn),對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能聚類(lèi)分析,共分為17類(lèi)。與正常對(duì)照組相比,損傷組促進(jìn)細(xì)

10、胞增殖的基因有6條上調(diào)、2條下調(diào),抑制細(xì)胞增殖的基因4條上調(diào)、1條下調(diào)；抗細(xì)胞凋亡基因有6條上調(diào)、1條下調(diào),促細(xì)胞凋亡基因有6條上調(diào)、2條下調(diào)。與損傷組相比,神經(jīng)移植組促進(jìn)細(xì)胞增殖的基因有2條上調(diào)、2條下調(diào),抑制細(xì)胞增殖的基因沒(méi)有上調(diào)、只有1條下調(diào)；抗細(xì)胞凋亡基因和促細(xì)胞凋亡基因分別有1條上調(diào),沒(méi)有下調(diào)。(5)毛囊神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定：原代培養(yǎng)的毛囊神經(jīng)干細(xì)胞,細(xì)胞從毛囊隆突區(qū)遷出并增殖,傳代后無(wú)血清培養(yǎng)14 d,免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)

11、可鑒定為Nestin陽(yáng)性的神經(jīng)干細(xì)胞；傳代細(xì)胞經(jīng)血清誘導(dǎo)14 d后,免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)顯示可誘導(dǎo)為GFAP陽(yáng)性的星形膠質(zhì)細(xì)胞和β-tubulin Ⅲ陽(yáng)性的神經(jīng)元。(6)轉(zhuǎn)染bFGF毛囊神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)G418篩選8 d后,免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)該細(xì)胞呈Nestin陽(yáng)性,bFGF在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)。(7)轉(zhuǎn)染bFGF毛囊神經(jīng)干細(xì)胞移植入大鼠受損視神經(jīng)中,在術(shù)后7d、14d仍能存活,并向視神經(jīng)損傷區(qū)遠(yuǎn)側(cè)段遷移,注入相同細(xì)胞數(shù)量時(shí),鏡下可見(jiàn)在7 d存

12、活細(xì)胞數(shù)比14 d時(shí)多,但14 d時(shí)細(xì)胞向遠(yuǎn)側(cè)端遷移的更遠(yuǎn)。(8)免疫組織化學(xué)染色：與損傷組相比,空白質(zhì)粒組和細(xì)胞移植組視神經(jīng)遠(yuǎn)側(cè)段的Nestin、MBP、NF陽(yáng)性物質(zhì)均有上升趨勢(shì),GFAP則逐漸減少；與空白質(zhì)粒組相比,細(xì)胞移植組視神經(jīng)遠(yuǎn)側(cè)段的Nestin、NF陽(yáng)性物質(zhì)均增多,只有GFAP陽(yáng)性區(qū)的面積稍有下降。 結(jié)論：視神經(jīng)損傷后,經(jīng)移植自體預(yù)變性腓總神經(jīng),視神經(jīng)的細(xì)胞數(shù)量增加,細(xì)胞增殖指數(shù)上升,凋亡細(xì)胞比例減少,PCNA的表達(dá)

13、量上調(diào),凋亡、增殖相關(guān)的基因表達(dá)發(fā)生變化,整個(gè)視神經(jīng)微環(huán)境有利于受損視神經(jīng)再生修復(fù)。特別是在移植了PDsRed2-N1-bFGF轉(zhuǎn)染毛囊神經(jīng)干細(xì)胞后,相對(duì)于空白質(zhì)粒移植組,細(xì)胞數(shù)量增加明顯,神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞排列緊密,促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白表達(dá)增加,有利于受損視神經(jīng)再生。結(jié)果證實(shí)了移植預(yù)變性自體腓總神經(jīng)或轉(zhuǎn)染bFGF毛囊神經(jīng)干細(xì)胞,能增加受損視神經(jīng)的細(xì)胞數(shù)量,抑制細(xì)胞凋亡,改善視神經(jīng)再生微環(huán)境,改變了一些相關(guān)的基因表達(dá),促進(jìn)了受損神經(jīng)的再生修復(fù)