灌注法去細(xì)胞技術(shù)構(gòu)建組織工程喉的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、全喉切除后的功能重建目前仍無理想方法。臨床常規(guī)治療方法是封閉咽喉部、氣管造瘺維持呼吸，給患者和社會造成很大負(fù)擔(dān)。據(jù)國際無喉者聯(lián)合會統(tǒng)計，每年有14萬左右喉癌患者需要施行全喉切除術(shù)[1]。理想的喉功能重建應(yīng)達(dá)到[2-4]：①用近似正常的呼吸氣流和聲帶結(jié)構(gòu)重新發(fā)音；②建立沒有誤咽的吞咽功能；③經(jīng)口咽和鼻腔維持上呼吸道和上消化道功能；④滿足美容要求。
　　從目前的情況看喉移植仍是治療全喉切除患者最有效的途徑。但是喉移植患者需終身服用免疫

2、抑制劑，有可能造成原有腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移、多重感染等嚴(yán)重后果[5]，而喉是非生命必需器官，是否值得冒生命危險來做這種移植術(shù)是一直爭議的問題。如果找到一種方法能降低移植喉的免疫原性，從而不使用免疫抑制劑或者僅在移植當(dāng)時短暫使用免疫抑制劑，則可能使喉移植應(yīng)用于更多的患者。近年來組織工程的迅猛發(fā)展為解決這一問題帶來了新的途徑。去細(xì)胞生物支架是利用化學(xué)方法去除組織或器官內(nèi)的細(xì)胞成分而保留其天然三維空間結(jié)構(gòu)，其主要成分為膠原，無免疫原性或免疫原性極低

3、，可為新組織的生成提供結(jié)構(gòu)性支架和誘導(dǎo)細(xì)胞粘附，遷移和增殖[6]。
　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源廣泛，存在于成人骨髓、脂肪組織、皮膚及肌肉等組織，且在體外能迅速擴(kuò)增，并有多向分化潛能，因此作為一種理想的種子細(xì)胞已經(jīng)越來越多地運(yùn)用到組織工程修復(fù)重建領(lǐng)域[7,8]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)5-氮雜胞苷誘導(dǎo)后可以轉(zhuǎn)化為骨骼肌細(xì)胞或心肌細(xì)胞，此方法也是目前國內(nèi)外運(yùn)用較常見的成肌誘導(dǎo)方法之一[9]。
　　本研究利用供體完整的喉軟骨作支架，喉上動

4、脈及甲狀腺上動脈內(nèi)灌注技術(shù)去除環(huán)甲肌、環(huán)杓后肌、環(huán)杓側(cè)肌、甲杓肌及粘膜等具有高免疫原性的軟組織，但保留喉肌群細(xì)胞外基質(zhì)的三維空間結(jié)構(gòu)及完整的喉軟骨支架結(jié)構(gòu)，用受體自身骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外進(jìn)行成肌誘導(dǎo)并擴(kuò)增后，充填細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成完整喉體，包埋在自體大網(wǎng)膜內(nèi)。探討利用灌注法脫細(xì)胞技術(shù)構(gòu)建組織工程化全喉支架的可行性，為全喉切除后喉重建提供新的解決途徑。
　　目的
　　1.比較灌注法與浸泡法構(gòu)建去細(xì)胞全喉支架的異同，為去細(xì)胞全喉作為

5、組織工程載體選擇最佳制備方案。
　　2.探討兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)體外條件培養(yǎng)下的生物學(xué)特性及誘導(dǎo)后分化為肌細(xì)胞的可能性。
　　3.通過將灌注法構(gòu)建的去細(xì)胞全喉支架與成肌誘導(dǎo)后的BMSCs共同培養(yǎng)，探討利用灌注法脫細(xì)胞技術(shù)構(gòu)建組織工程化全喉支架的可行性，為全喉切除后喉重建提供新的解決途徑。
　　方法
　　1.灌注法與浸泡法構(gòu)建去細(xì)胞全喉支架的對比研究
　　根據(jù)不同處理方法分為灌注法去細(xì)胞組和浸泡法

6、去細(xì)胞組，分別用灌注法和浸泡法對離體全喉進(jìn)行去細(xì)胞處理，并保留喉肌群細(xì)胞外基質(zhì)的三維空間結(jié)構(gòu)及完整的喉軟骨支架結(jié)構(gòu)，制備后的喉分別進(jìn)行大體觀察、組織學(xué)和掃描電鏡觀察及去細(xì)胞喉支架軟骨活力測試。
　　2.BMSCs的分離及誘導(dǎo)培養(yǎng)的研究
　　穿刺法抽取青紫藍(lán)兔雙側(cè)股骨骨髓，分離培養(yǎng)BMSCs后，再經(jīng)過5-氮雜胞苷誘導(dǎo)培養(yǎng)，通過倒置顯微鏡、細(xì)胞生長曲線描繪及免疫細(xì)胞化學(xué)染色，研究其體外生長及誘導(dǎo)分化情況。
　　3．灌注法去

7、細(xì)胞技術(shù)構(gòu)建組織工程喉的實(shí)驗(yàn)研究
　　新西蘭大白兔作為喉支架供體，通過雙側(cè)頸總動脈順行灌注去離子劑，構(gòu)建出具有喉肌去細(xì)胞外基質(zhì)及活性軟骨的全喉支架。青紫藍(lán)兔為受體兔，取其BMSCs，誘導(dǎo)培養(yǎng)為骨骼肌細(xì)胞后注入全喉支架的去細(xì)胞基質(zhì)中。體外培養(yǎng)一天后異位移植入受體兔大網(wǎng)膜。分別在4周，8周取出標(biāo)本進(jìn)行大體觀察，組織學(xué)及免疫組織化學(xué)檢測。
　　結(jié)果
　　1.灌注法與浸泡法構(gòu)建去細(xì)胞全喉支架的對比研究
　　大體觀察：灌注

8、法去細(xì)胞組離體喉經(jīng)十二烷基硫酸鈉（SDS）灌注兩小時后即透明，而浸泡法去細(xì)胞組離體喉經(jīng)SDS浸泡16小時所得喉體仍顯粉紅色。組織學(xué)與掃描電鏡觀察：灌注組喉肌群去細(xì)胞程度完全，孔隙多，膠原纖維未受損，且軟骨細(xì)胞活力保存完好。浸泡組所得去細(xì)胞全喉支架在取出的樣本檢測中仍殘留大量的細(xì)胞碎屑，且部分軟骨細(xì)胞壞死，餡窩多呈現(xiàn)空泡狀。軟骨細(xì)胞活力測定：灌注組軟骨活性全部保持在85％以上，浸泡組軟骨活性則低于80％。灌注法去細(xì)胞支架軟骨活力高于浸泡法

9、去細(xì)胞支架軟骨活力（P<0.01）。
　　2.BMSCs的分離及誘導(dǎo)培養(yǎng)的研究
　　原代培養(yǎng)的BMSCs在經(jīng)密度梯度離心法處理后48-72小時基本完全貼壁，形態(tài)多為短梭形，之后可見貼壁細(xì)胞逐漸分裂增殖呈漩渦樣生長，7-10天即可融合形成單層。細(xì)胞生長曲線從第1代（P1）到第7代（P7）無明顯變化，第3代（P3）到第5代（P5）生長明顯活躍。經(jīng)5-氮雜胞苷誘導(dǎo)培養(yǎng)3周后的細(xì)胞仍保持梭形，且免疫細(xì)胞化學(xué)染色出現(xiàn)陽性表達(dá)。

10、　　3．灌注法去細(xì)胞技術(shù)構(gòu)建組織工程喉的實(shí)驗(yàn)研究
　　所有動物未出現(xiàn)手術(shù)意外，均存活到取標(biāo)本時。4周及8周時大體觀察發(fā)現(xiàn)喉支架完整，其表面有血管形成。HE染色顯示有肌束樣組織存在，免疫組織化學(xué)檢測肌束樣組織及血管樣組織α-肌動蛋白表達(dá)陽性。
　　結(jié)論
　　1.灌注法較浸泡法所制備的去細(xì)胞全喉的去細(xì)胞效果更佳，且更完整地保留了軟骨活性，提供了較完整的去細(xì)胞全喉支架，所得的去細(xì)胞全喉支架是一種理想的細(xì)胞載體。
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