Toll樣受體2介導(dǎo)的天然免疫在大鼠肝移植缺血再灌注損傷過程中的研究.pdf

1、背景:歷經(jīng)40多年的蓬勃發(fā)展，目前肝移植已經(jīng)成為終末期肝病的有效治療方法，并在80年代被美國FDA認(rèn)可。全球許多單位都已開展了臨床肝移植，在先進(jìn)的移植中心，1年存活率可達(dá)90％，5年存活率在75％～80％。手術(shù)后患者生活質(zhì)量迅速好轉(zhuǎn)?？墒歉我浦才畈l(fā)展的背后潛藏著很大的危機(jī)一供體短缺，每年有大量的病人在等待移植中死去。肝臟已經(jīng)成為珍稀資源。而目前肝移植中原發(fā)性移植物無功能或功能不全的發(fā)生率為2～23％，是引起肝移植早期死亡的重要原因。而

2、肝臟的缺血再灌注損傷對于移植肝臟的原發(fā)性無功能或功能不全的發(fā)生起著重要的作用。而且由于供體的巨大短缺使得非最佳供肝不得不成為一種臨床選擇，如脂肪肝、酒精肝等。而這樣的肝臟對于缺血再灌注損傷更佳敏感，移植失敗率明顯增加。在目前供體短缺的窘迫背景下，盡量減少肝臟缺血再灌注損傷已成為臨床肝移植發(fā)展的迫切要求。 缺血再灌注損傷涉及許多復(fù)雜的機(jī)制。其中Kupffer細(xì)胞的活化是關(guān)鍵因素。目前有文獻(xiàn)報(bào)道LPS活化Kupffer細(xì)胞依賴于To

3、ll樣受體介導(dǎo)的先天免疫過程。 Toll樣受體(TLRs，Tolllikereceptors)最早是在研究果蠅細(xì)胞胚胎發(fā)育中發(fā)現(xiàn)的，隨后發(fā)現(xiàn)它在介導(dǎo)成年果蠅天然免疫機(jī)制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起重要作用。正是這一受體激發(fā)了早期抵抗感染的炎癥細(xì)胞因子的生成，并啟動機(jī)體的炎癥防御機(jī)制，因而被比喻為它給機(jī)體發(fā)出了戰(zhàn)斗警報(bào)，敲響了入侵者的喪鐘(Tollthebell)。TLRs被認(rèn)為是病原體識別和特異性免疫應(yīng)答之間的重要紐帶，識別PAMPs(病原

4、相關(guān)分子模式，pathogenassociatedmolecularpattern)，其中TLR2(toll-likereceptor-2)還參與對物理、化學(xué)及缺血等非感染因素所致的細(xì)胞壞死的識別和炎癥反應(yīng)。TLR2被激活后，通過一系列胞內(nèi)信號分子傳導(dǎo)，激活核因子核因子-kappaB(NF-κB)等多種轉(zhuǎn)錄因子，從而啟動促炎癥因子，如腫瘤壞死因子-alpha(TNF-alpha)、白介素-1(IL-1)等靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，產(chǎn)生炎癥放大

5、效應(yīng)。 由于這些炎癥反應(yīng)細(xì)胞因子在肝臟缺血再灌注損傷中的發(fā)揮著重要作用，因此詳盡的了解其上游信號通路對于認(rèn)識其發(fā)病機(jī)制，提供干預(yù)治療措施都是十分重要的。 目的:研究肝移植缺血再灌注損傷中，TLR2天然免疫的激活及對下游信號分子的調(diào)控，探討TLR2參與缺血再灌注損傷的機(jī)制，并研究缺血預(yù)處理對其生物學(xué)作用的影響，探討其與獲得性免疫之間可能存在的聯(lián)系。 方法:將大鼠隨機(jī)分成三組：缺血再灌注組、缺血預(yù)處理組和假手術(shù)組。首

6、先利用自行設(shè)計(jì)的橫桿支架建立穩(wěn)定的大鼠肝移植模型，然后以DA-Lewis大鼠移植為研究模型。設(shè)定術(shù)后2h，4h，24h時間點(diǎn)，分別取材，檢測肝功能(ALT、LDH)、氧自由基(MDA、SOD、NO)。門靜脈內(nèi)毒素。病理學(xué)動態(tài)觀察。Elisa檢測TNF-a、IL-2。半定量RT-PCR檢測TLR2、TNF-a、NF-KB、ICAM-1的基因表達(dá)。免疫組化分析TNF-a、TLR2、ICAM-1蛋白。流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血中共刺激分子CD80、

7、CD86。 結(jié)果:利用自行設(shè)計(jì)的橫桿支架，單人可以順利實(shí)施大鼠肝移植。建模期共進(jìn)行SD-SD大鼠原位肝移植120例，其中穩(wěn)定模型80例，穩(wěn)定模型期手術(shù)24h存活率約95％，一周存活率86.3％，一月存活率80％。DA-Lewis大鼠肝移植10例術(shù)后一周全部存活，術(shù)后一周肝功能檢測發(fā)現(xiàn)ALT異常升高(3550.50±675.66vs49.7±9.2u/L，P＜0.01)，病理切片發(fā)現(xiàn)匯管區(qū)淋巴細(xì)胞大量浸潤。 移植后I/R組

8、ALT、LDH較SH組迅速升高，尤其是術(shù)后4h(ALT986.83±89.78vs51.0±7.61u/L，p＜0.01;LDH15429.33±1447.61vs492.33±111.23u/L，p＜0.01)，MDA也明顯上升(4h31.87±4.68vs6.64±1.15nmol/mL，P＜0.01)，SOD下降(4h387.45±32.07vs597.27±39.15NU/mL，P＜0.01)NO逐漸上升，24h最高(24h50

9、.58±13.76vs15.12±3.31umol/L，P＜0.01)。內(nèi)毒素上升(4h7.73±1.80vs0.68±0.10EU/mL，P＜0.01)，病理組織切片可見肝細(xì)胞明顯腫脹、變性、少數(shù)壞死。預(yù)處理后，相應(yīng)指標(biāo)都有改善：ALT(4h695.83±55.21vs986.83±89.78u/L，p＜0.01)，LDH(4h9579.83±928.28vs15429.33±1447.6lu/L，p＜0.01)，MDA(4h24.3

10、5±3.57vs31.87±4.68nmol/mL)，SOD(4h471.73±47.35vs387.45±32.07NU/mL，P＜0.01)，NO(24h32.53±6.53vs50.58±13.76umol/L，P＜0.01)，內(nèi)毒素(4h5.89±0.99vs7.73±1.80EU/mL，P＜0.01)。病理切片可見細(xì)胞腫脹、變性、壞死程度減輕。 移植后TLR2相關(guān)信號分子的各項(xiàng)檢測指標(biāo)均有明顯上升(與SH組相比)。TN

11、F-a術(shù)后4小時最高(246.94±42.28vs39.99±6.67pg/mL，p＜0.01)，IL-2術(shù)后持續(xù)上升(24h162.46±25.0vs11.28±1.28pg/mL，p＜0.01)，TLR2mRNA2小時表達(dá)最強(qiáng)(3.04±0.25vs0.48±0.05，P＜0.01)，TNF-amRNA(4h0.68±0.08vs0.09±0.02pg/mL，p＜0.01)，NF-KBmRNA(4h1.01±0.17vs0.11±0

12、.01，p＜0.01)。免疫組化染色，TLR2、TNF-a4小時最強(qiáng)，流式檢測CD80/CD86持續(xù)上升。 預(yù)處理后TLR2相關(guān)信號分子的各項(xiàng)檢測指標(biāo)明顯下降(與I/R組比較)。TNF-a血清水平(4h184.90±23.09vs246.94±42.28pg/mL，p＜0.01)，IL-2血清水平(24h114.66±19.08vs162.46±25.0pg/mL，p＜0.01)。流式細(xì)胞術(shù)檢測CD80/CD86明顯下降。TLR

13、2mRNA(2h2.27±0.13vs3.04±0.25.p＜0.01)，TNF-amRNA(4h0.46±0.09vs0.68±0.08，p＜0.01)，NF-KBmRNA(4h0.82±0.07vs1.01±0.17，p＜0.01)。免疫組化染色發(fā)現(xiàn)TLR2、TNF-a的表達(dá)均減弱。 移植后ICAM-1mRNA表達(dá)持續(xù)上調(diào)(與SH組比)(24h0.90±0.17vs0.11±0.03，p＜0.01)，預(yù)處理后表達(dá)下調(diào)(與I/

14、R組比)(24h0.52±0.16vs0.90±0.17，p＜0.01)免疫組化分析，發(fā)現(xiàn)ICAM-1分子在移植后24小時表達(dá)最高，預(yù)處理后表達(dá)減弱。 結(jié)論:在自行設(shè)計(jì)的橫桿支架的協(xié)助下，單人可獨(dú)立行大鼠原位肝移植。縮短無肝期、預(yù)防圍手術(shù)期并發(fā)癥的發(fā)生是術(shù)后長期存活的關(guān)鍵。DA-Lewis大鼠肝移植可以在術(shù)后1周發(fā)生急性排斥反應(yīng)。TLR2在肝缺血再灌注中被激活，并隨損傷程度而動態(tài)變化，其下游炎癥分子的變化與其一致，說明TLR2可