青藤堿保護大鼠原位肝移植缺血再灌注損傷的實驗研究.pdf

1、肝臟缺血再灌注損傷是肝臟移植中常見的問題之一,缺血再灌注引起的肝臟損傷是一個連續(xù)不斷的過程,并最終導(dǎo)致肝細胞損傷。這個過程是在肝臟短暫缺氧并再氧合時觸發(fā),臨床上許多情況下可發(fā)生肝臟缺血再灌注,例如肝臟低灌流狀態(tài),各種各樣的外科手術(shù)操作,以及移植中的供體器官切取。實際上肝臟缺血再灌注損傷是抗原成分獲取的結(jié)果,是影響肝臟移植結(jié)果的重要因素,引起10％左右的早期移植后器官功能衰竭,并且急性和慢性排異的發(fā)生率較高。此外,由于邊緣性供體對于缺血再

2、灌注損傷非常敏感,這加劇了供體器官的短缺。因此減少缺血再灌注損傷能明顯增加獲得手術(shù)成功的病人數(shù)量。然而,到目前為止仍沒有可以預(yù)防缺血再灌注損傷的有效方法。所以,為了保護細胞和器官的功能,需要通過廣泛的研究更好的了解肝臟缺血再灌注損傷的機制以及尋找合適的干預(yù)方法必要的。 青藤堿是從防己科防己屬植物青風(fēng)藤Sinomenium acutum Rehd.et Wils.根莖中分離出的主要活性成分,其結(jié)構(gòu)類似于嗎啡,分子式為C19H23N

3、O4,分子量為329.38,具有鎮(zhèn)痛,抗炎等作用,臨床主要用于類風(fēng)濕病的治療,療效確切。國內(nèi)外的研究表明,青藤堿具有良好的抗炎、免疫抑制作用。但是在缺血再灌注損傷中的作用卻未見報道。本課題應(yīng)用“二袖套”法建立大鼠原位肝移植模型,研究青藤堿在肝臟缺血再灌注損傷中的保護作用,并對其作用機制進行探討。 第一部分：青藤堿對大鼠原位肝移植缺血再灌注損傷的保護作用 目的：探討青藤堿對大鼠原位肝移植缺血再灌注損傷的保護作用。

4、方法：應(yīng)用SD大鼠為模型動物；采用Kamada's“二袖套法”建立SD→SD大鼠原位肝移植模型,大鼠196只隨機分為假手術(shù)組、生理鹽水對照組、低劑量(40mg/kg)和高劑量青藤堿治療組(80mg/kg),將供肝在4℃林格液中保存5h后植入受體,分別觀察移植術(shù)后1周存活率,檢測移植術(shù)后2,6,12,24h血清ALT、AST,TUNEL法檢測肝細胞凋亡指數(shù)(AI),RT-PCR檢測肝臟組織中的TNF-a、IL-1B、ICAM-1mRNA的

5、含量,ELISA檢測血清IL-2含量,并觀察移植肝臟病理形態(tài)學(xué)的改變。 結(jié)果： 與對照組比較,青藤堿低劑量、高劑量治療組術(shù)后1周存活率顯著提高(75％,75％vs 12.5％,P<0.01),在各個時間點,青藤堿治療組的ALT、AST水平明顯低于生理鹽水對照組(P<0.01),肝組織中的TNF-a、IL-1B、ICAM-1mRNA表達與對照組相比均顯著減少(P<0.01),肝細胞凋亡指數(shù)下降,在肝移植術(shù)后24小時,生理鹽

6、水對照組的AI為37.0±4.30,而在青藤堿兩治療組分別為23.8±3.27、18.6±3.03,與對照組相比有顯著差異(P<0.01)。血清IL-2含量降低,肝細胞和肝竇內(nèi)皮細胞形態(tài)也明顯改善。 結(jié)論：青藤堿可以通過抑制Kupffer細胞激活及釋放TNF-a、IL-1B等炎癥性細胞因子及ICAM-1等粘附分子,抑制肝細胞凋亡,減少細胞免疫相關(guān)IL-2的分泌,減輕肝細胞及肝竇內(nèi)皮細胞的損傷,達到保護肝移植缺血再灌注損傷的效果。

7、 第二部分：青藤堿對大鼠肝移植缺血再灌注后TLR4、MAPKs和NF-kB表達的影響 目的：通過觀察不同劑量的青藤堿對大鼠肝移植術(shù)后TLR4、MAPKs和NF-κB的影響,探討青藤堿保護大鼠肝移植缺血再灌注損傷的機制。 方法：應(yīng)用“二袖套法”建立SD→SD大鼠原位肝移植模型,大鼠196只隨機分為假手術(shù)組、對照組、低劑量(40mg/kg)和高劑量青藤堿治療組(80mg/kg),將供肝在4℃林格液中保存5h后植入受體

8、,選擇缺血再灌注后大鼠肝功能損傷最嚴重的術(shù)后6小時為觀察點。采用Western Blot方法檢測大鼠肝臟組織的TLR4、磷酸化JNK、ERK、p38 MAPK和NF-κB蛋白表達的變化情況。 結(jié)果：在假手術(shù)組TLR4呈低表達,生理鹽水對照組TLR4呈高表達,青藤堿顯著降低了肝組織TLR4的表達(P<0.01)。磷酸化JNK、ERK在各組的表達比較無明顯差異。磷酸化p38 MAPK和NF-κB在假手術(shù)組呈低表達,在生理鹽水對照組高

9、表達,而青藤堿明顯抑制了磷酸化p38 MAPK和NF-κB的表達(P<0.01)。 結(jié)論：青藤堿保護大鼠肝移植缺血再灌注損傷的機制與抑制TLR4介導(dǎo)的天然免疫反應(yīng)有關(guān),通過抑制p38MAPK信號通路和NF-κB通路,減少下游TNF-a、IL-1B和ICAM-1等炎癥細胞因子的分泌。 第三部分：青藤堿對肝臟缺血再灌注后抗原提呈細胞的影響 目的：通過觀察不同劑量的青藤堿對大鼠肝移植缺血再灌注后肝臟來源的DC成熟和功能

10、的影響,深入了解青藤堿保護缺血再灌注損傷作用的機制。 方法：應(yīng)用“二袖套法”建立SD→SD大鼠原位肝移植模型,大鼠48只隨機分為生理鹽水對照組、低劑量(40mg/kg)和高劑量青藤堿治療組(80mg/kg),將供肝在4℃林格液中保存2h后植入受體,術(shù)后第三天切取肝臟,分離純化肝臟DC,觀察青藤堿對其成熟和功能的影響。以熒光抗體標記和流式細胞儀對DC進行表型分析OX62和MEtC-Ⅱ、CD86等分子。EACS檢測移植后肝臟DC對熒

11、光標記的卵清蛋白(OVA-FITC)能力,分析青藤堿對肝臟DC內(nèi)吞功能的影響。收集獲取的DC,用RT-PCR方法測定其中具有免疫調(diào)節(jié)作用的細胞因子IL-12,IL-1,TNF-a mRNA的表達水平,Western Blot方法檢測各組肝臟DC表達的TLR4。收集各處理組肝臟DC以3H-TdR摻入法進行DC刺激同種異基因T細胞增殖功能(MLR)的檢測。 結(jié)果：FACS分析顯示,青藤堿處理組DC呈現(xiàn)不成熟DC的表型,DC表面MHC

12、-Ⅱ類分子和CD86等分子表達均顯著下降,而對照組則表現(xiàn)為成熟DC表型,高表達MHC-Ⅱ類分子和CD86分子。內(nèi)吞功能試驗發(fā)現(xiàn)青藤堿處理組平均熒光強度較對照組的明顯增強,表明了青藤堿對肝臟DC向成熟DC轉(zhuǎn)化具有抑制作用。提示青藤堿可顯著降低缺血再灌注后肝臟DC的抗原提呈功能。對照組肝臟DC表達IL-12,IL-1,TNF-a mRNA等水平明顯增高,TLR4蛋白的表達明顯升高,而青藤堿處理組可不同程度抑制這種效應(yīng)(P<0.01)。DC刺