腺相關病毒介導的Ac45基因沉默在牙周炎及根尖周炎中牙槽骨保護作用的研究.pdf

1、牙周炎及根尖周炎等口腔感染性疾病影響了超過80％的成年人群。其病程中，病原體引起口腔局部炎癥，刺激破骨細胞分化和活動，最終可導致牙槽骨喪失，牙齒松動，甚至牙齒缺失。近年來有研究表明，Ac45基因可作為溶骨性疾病的新型治療靶點，而且該基因對局部免疫應答也可能有一定影響。腺相關病毒(Adeno-associated virus，AAV)介導的RNA干擾是目前新穎有效的一種基因治療手段，治療后免疫反應輕微，安全性高。該研究采用攜帶短發(fā)夾RNA

2、的腺相關病毒作為載體，構建以Ac45為靶點的shRNA腺相關病毒（AAV-sh-Ac45），特異性下調Ac45表達，研究其在牙周炎，根尖周炎中的牙槽骨保護作用及對局部炎癥免疫反應的影響，并初步探討其作為牙周炎和根尖周炎一種新的基因治療的潛力。
　　目的：構建下調Ac45表達的AAV-sh-Ac45，通過體外及體內實驗，采用完善建立的牙周炎及根尖周炎小鼠模型，研究其對牙槽骨吸收和局部炎癥免疫反應的影響，為建立牙周炎及根尖周炎的基因治

3、療新方法提供依據。
　　方法：⑴構建以AAV為載體，特異性靶向Ac45的shRNA，轉染體外培養(yǎng)的破骨細胞，通過抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色，吖啶橙染色和F-肌動蛋白環(huán)染色檢測破骨細胞的分化和酸化，通過麥胚凝集素染色和掃描電鏡檢測骨吸收情況。⑵通過小鼠口腔給菌，建立實驗性牙周炎模型，各組小鼠分別給予AAV-sh-Ac45和AAV-sh-luc-YFP（陽性對照），并用正常未給菌小鼠作為陰性對照。第56天處死動物，收集牙槽骨樣

4、本。通過亞甲基藍染色和HE染色檢測牙周骨質吸收情況。對樣本進行TRAP染色，免疫組化和免疫熒光染色，研究AAV-sh-Ac45對破骨細胞數量和功能，以及對Ac45，Cath K，CD3，F4/80等的表達的影響。采用酶聯免疫吸附測定進行IL-1α，IL-6，IL-10，IL-12，IL-17A和TNF-α的表達水平的檢測。實時聚合酶鏈式反(Real-time quantitative PCR，RT-qPCR)應用于分析Cath K，RA

5、NKL，OPG，TNF噸，IL-1α，IL-6和IL-17A的表達水平。⑶小鼠下頜第一磨牙開髓，疏通根管并感染細菌以建立根尖周炎模型，各組小鼠分別給予AAV-sh-Ac45和AAV-sh-luc-YFP，并用正常未開髓小鼠作為陰性對照。手術后第42天處死動物。采用Micro CT及HE染色分析根尖周病變特征及病灶區(qū)域大小。采用免疫組化和免疫熒光染色檢測Ac45表達及相關免疫反應。提取根尖周炎病變的總RNA和蛋白質，檢測炎性因子以及破骨細

6、胞相關基因水平的變化。
　　結果：①在體外培養(yǎng)的破骨細胞內通過AAV介導的RNA干擾技術顯著下調了Ac45表達，破骨細胞分化和酸化功能受到抑制，骨吸收顯著降低。②在細菌誘導的小鼠牙周炎模型中，AAV-sh-Ac45有效感染牙周組織并下調Ac45表達，抑制了牙槽骨吸收，牙周組織內單核細胞浸潤減少，樹突狀細胞，T細胞，巨噬細胞和破骨細胞顯著減少，局部炎癥反應得到抑制。牙周組織局部破骨細胞相關基因和促炎性細胞因子表達水平也顯著降低。③在