2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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1、目的:克隆、構(gòu)建攜帶編碼小鼠全長(zhǎng)膜型klotho(mKL)cDNA的腺相關(guān)病毒載體(rAAV.mKL);并利用rAAV.mKL轉(zhuǎn)染去勢(shì)骨質(zhì)疏松大鼠,觀察KL對(duì)去勢(shì)骨質(zhì)疏松大鼠骨代謝及骨微細(xì)結(jié)構(gòu)的影響,揭示KL在骨質(zhì)疏松骨代謝中的調(diào)控機(jī)制。
  方法:(1)從小鼠腎臟組織中提取總RNA,RT-PCR擴(kuò)增小鼠全長(zhǎng)mKL蛋白基因片段,將其克隆到pAAV-HnGFP質(zhì)粒上,構(gòu)建重組質(zhì)粒pAAV-mKL,將其轉(zhuǎn)染COS-7真核表達(dá)細(xì)胞,通過(guò)

2、觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)、RT-PCR和免疫熒光檢測(cè)KL在COS-7中的表達(dá),三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入AAV-293細(xì)胞,包裝rAAV.mKL;(2)rAAV.mKL轉(zhuǎn)染去勢(shì)骨質(zhì)疏松大鼠,觀察KL表達(dá)對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠骨代謝及骨微細(xì)結(jié)構(gòu)的影響。將SD雌性大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(S組)和手術(shù)組,外科去勢(shì)術(shù)后12周再隨機(jī)分為模型組(O組)、17β-雌二醇組(E組)、KL基因組(KO組)和空質(zhì)粒組(GO組),實(shí)驗(yàn)12周后處死。ELISA法檢測(cè)

3、血漿KL、骨鈣素、雌激素表達(dá)水平;雙能X線(xiàn)檢測(cè)股骨、脛骨骨密度;冰凍切片及免疫組化法觀察腎KL熒光及KL蛋白表達(dá);RT-PCR和免疫組化法檢測(cè)骨Runx2、MMP-13 mRNA及蛋白表達(dá);HE染色觀察骨組織形態(tài)學(xué)變化;透射電鏡觀察骨細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。
  結(jié)果:(1)通過(guò)RT-PCR獲得全長(zhǎng)小鼠mKL cDNA片段,成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pAAV.mKL,驗(yàn)證了其在COS-7細(xì)胞中高表達(dá),三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染AAV-293細(xì)胞,包裝出rAAV

4、.mKL,提取病毒DNA,PCR驗(yàn)證rAAV.mKL攜帶有小鼠KL cDNA片段;(2)rAAV.mKL轉(zhuǎn)染可減緩去勢(shì)大鼠骨質(zhì)疏松癥的發(fā)展并改善骨微細(xì)結(jié)構(gòu)的破壞。0組KL、骨鈣素、雌激素血漿表達(dá)明顯受到抑制,KO組KL、骨鈣素水平明顯升高;KO組和E組骨密度高于O組和GO組(P<0.05);KO組大鼠腎有小鼠KL基因特異性表達(dá);與O組相比,KO組Runx2 mRNA表達(dá)明顯上調(diào),MMP-13 mRNA表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05);免疫組

5、化分析KO組Runx2吸光度值顯著高于O組(P<0.05);KO組MMP-13吸光度值顯著低于O組(P<0.05)。HE顯示KO組、E組和S組大鼠骨小梁排列緊密,連接成網(wǎng),形態(tài)結(jié)構(gòu)較完整,明顯優(yōu)于O組和GO組。透射電鏡顯示O組、GO組骨細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)髓樣結(jié)構(gòu),而KO組、S組均未發(fā)現(xiàn)。
  結(jié)論:(1)成功構(gòu)建攜帶全長(zhǎng)mKL cDNA腺相關(guān)病毒載體,將其轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞后可明顯上調(diào)KL的表達(dá);(2)rAAV.mKL轉(zhuǎn)染去勢(shì)骨質(zhì)疏松癥大

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