復(fù)合SDF-1α的組織工程血管支架在小口徑人造血管移植和重建中的研究.pdf

1、血管移植是目前血管病治療的一種普遍手術(shù)方法，由于自體血管移植存在種種缺陷，因此應(yīng)用細(xì)胞或不應(yīng)用細(xì)胞的組織工程血管支架在體外試驗(yàn)中被研制。但是這類方法制作的血管花費(fèi)大量的時(shí)間，并不適用于緊急治療的需要。而目前臨床應(yīng)用的人造血管由于易于急性血栓形成往往限于直徑較大血管，且遠(yuǎn)期研究?jī)?nèi)皮化率較低，小口徑人造血管易于血栓的高形成率目前尚無法適用臨床治療。具有生物活性的組織工程血管支架(TEVG)如果要用于血管移植對(duì)材料和其攜帶的生物活性物質(zhì)的高組

2、織相容性提出要求。在本研究中我們闡述了應(yīng)用靜電紡絲技術(shù)，同時(shí)采用高分子聚合材料PLLA/PCL，一步法制作的具有生物活性、人工合成、可降解、高組織相容性并具有細(xì)胞外基質(zhì)特性的小口徑組織工程血管支架，同時(shí)將這一新型血管支架移植于動(dòng)物體內(nèi)，并通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究其在原位血管重建的功能，同時(shí)發(fā)現(xiàn)這類新型血管支架在重建過程中具有同時(shí)吸引兩種干細(xì)胞的功能。
　　第一部分靜電紡絲PLLA/PCL小口徑血管支架的制作和特性研究
　　目的:應(yīng)

3、用靜電紡絲技術(shù)選折合適材料制作具有生物力學(xué)特性的組織工程血管支架。
　　方法:使用高分子可降解材料左旋聚乳酸/聚己酸內(nèi)酯以19％/5％的質(zhì)量比例濃度混合物和單純左旋聚乳酸分別溶解于六氟異丙醇，應(yīng)用靜電紡絲技術(shù)電紡于直徑為1mm的圓柱形棒狀接收屏，制成組織工程血管支架，在掃描電鏡分析紡絲直徑并測(cè)試其機(jī)械力學(xué)特性。
　　結(jié)果:1.濃度為19％PLLA/5％PCL溶液靜電紡所得的纖維平均直徑982.3nm符合納米材料的直徑要求。2

4、.靜電紡所得組織工程血管支架平均內(nèi)徑1.000mm±0.013mm，平均外徑1.302mm±0.021mm，平均厚度150.1μm±10.5μm。3.19％PLLA/5％PCL支架平均楊氏模量為5.19±0.7 Mpa，19％PLLA和自體血管分別為12.85±0.11 Mpa、9.66±0.13 Mpa，具有顯著差異P＜0.05。
　　結(jié)論:采用靜電紡絲技術(shù)制備的組織工程小口徑血管支架的纖維寬度及空隙達(dá)到納米材料級(jí)別。PLLA/

5、PCL的抗拉性和延展性明顯優(yōu)于單純PLLA和自體血管，是較為理想的生物材料。PLLA/PCL支架的最大受力顯著優(yōu)于單純PLLA材料，但較自體血管小。
　　第二部分肝素-SDF-1α交聯(lián)的組織工程血管支架的藥物釋放及移植后物理特性研究
　　目的:應(yīng)用共價(jià)鍵化合特性將肝素交聯(lián)與血管支架上，基于肝素可與SDF-1α靜電電荷作用原理交聯(lián)SDF-1α于血管支架上，并檢測(cè)其穩(wěn)定性。使用采用血管內(nèi)直徑為1mm TEVG，應(yīng)用端端吻合技術(shù)植

6、入SD大鼠的頸總動(dòng)脈內(nèi)，研究其血管通常率和生物組織力學(xué)改特性的變。
　　方法:使用0.01N NaOH處理支架表面以增加羧基密度后應(yīng)用碳化二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺供價(jià)連接與羧基，使用聚乙二醇二胺作為肝素連接分子將肝素交聯(lián)于TEVG，用甲苯胺藍(lán)染色法測(cè)定肝素的釋放。SDF-1α與肝素相互作用后與肝素交聯(lián)，通過酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定測(cè)定SDF-1α的釋放。免疫組化觀察不同濃度的SDF-1α交聯(lián)后的染色強(qiáng)度。應(yīng)用端端吻合技術(shù)吻合TEVG于S

7、D大鼠左頸總動(dòng)脈之上，多普勒超聲驗(yàn)證各時(shí)間點(diǎn)血管通暢程度，各時(shí)間點(diǎn)取出支架后測(cè)試機(jī)械力學(xué)特性。
　　結(jié)果:通過甲苯胺藍(lán)試劑法測(cè)定，平均每個(gè)PLLA/PCL支架肝素含量濃度為15.31±2.31μg/mm3。通過夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定，以500ng/mlSDF-1α起始交聯(lián)濃度，平均每個(gè)PLLA/PCL支架SDF-1α含量濃度為140.5±4.1ng/mm3。SDF-1α交聯(lián)的起始溶液濃度和支架SDF-1α的結(jié)合濃度呈等比關(guān)系。

8、手術(shù)結(jié)束即刻通暢率為100％，肝素-SDF-1α組在除在第一周通暢率與肝素組接近外(88.9％)，其余各個(gè)時(shí)間點(diǎn)肝素-SDF-1α組的通暢率最高P＜0.05，肝素組的通暢率也高于空白對(duì)照組P＜0.05。肝素-SDF-1α組支架在4周后的機(jī)械強(qiáng)度與自體血管較為接近，達(dá)到了組織工程血管支架的力學(xué)要求，各時(shí)間點(diǎn)肝素-SDF-1α生物力學(xué)特性明顯優(yōu)于其他兩組(P＜0.05)。
　　結(jié)論:19％PLLA/5％PCL二元共混靜電紡絲，具有良好

9、的肝素交聯(lián)性能。肝素化PLLA/PCL支架可高效結(jié)合SDF-1α，制備有效的具有生物活性TEVG，SDF-1α起始交聯(lián)濃度可定為500ng/ml。肝素-SDF-1α組的TEVG近期及遠(yuǎn)期通暢率均明顯高于肝素組和空白對(duì)照組。肝素-SDF-1α組的TEVG在4周內(nèi)其彈性強(qiáng)度（彈性模量）接近并超過了自體血管的強(qiáng)度，肝素組和空白對(duì)照組在12周后彈性模量也接近了自體血管，19％PLLA/5％PCL的TEVG在植入體內(nèi)后其生物力學(xué)特性可接近自然血管

10、。
　　第三部分血管支架內(nèi)表面內(nèi)皮化功能的研究
　　目的:通過體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)研究生物活性組織工程血管支架內(nèi)皮化效率和機(jī)制。
　　方法:1.體外試驗(yàn):體外培養(yǎng)牛內(nèi)皮細(xì)胞，M199培養(yǎng)液中加入不同濃度的SDF-1α溶液，研究不同濃度SDF-1α對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力的影響。2.取出不同時(shí)間點(diǎn)的TEVG，應(yīng)用免疫組化方法分析TEVG內(nèi)表面的內(nèi)皮化率和內(nèi)皮化機(jī)制。
　　結(jié)果:對(duì)照組、肝素組15μg/ml、SDF-1α組濃度分

11、別為20ng/ml、50ng/ml、150ng/ml時(shí)，ECs細(xì)胞遷移數(shù)分別為3.5±0.58個(gè)，7.9±1.09個(gè)，18.3±1.73個(gè)，24.7±2.05個(gè)，31.1±2.46個(gè)，具有顯著差異P＜0.05。1周的SDF-1α組TEVG內(nèi)表面吸引更多的細(xì)胞(1570±413 mm2，n=3)，具有顯著差異性P＜0.05，且可以觀察到大量CD34+/CD133+/CD31-的EPCs聚集于內(nèi)表面。4周的SDF-1α組內(nèi)皮化率高于其他兩組

12、，CD34/CD133表達(dá)下調(diào)，內(nèi)皮細(xì)胞成熟。
　　結(jié)論:1.體外試驗(yàn)SDF-1α可有效吸引內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，證明SDF-1α可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移。2.肝素-SDF-1α交聯(lián)組的組織工程血管(TEVG)可有效的全程吸引內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)，在4周內(nèi)即有效全程內(nèi)皮化。
　　第四部分血管支架外表面的研究
　　目的:通過體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)研究生物活性組織工程血管支架對(duì)平滑肌祖細(xì)胞的吸引能力和平滑肌細(xì)胞分化成熟的能力研究。

13、>　　方法:1.體外試驗(yàn):手術(shù)取出各組種植3天TEVG體外細(xì)胞培養(yǎng)并鑒定細(xì)胞，并用Real-time PCR的檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)平滑肌細(xì)胞特異標(biāo)記物α-SMA、CNN1對(duì)應(yīng)的基因表達(dá)。2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn):免疫熒光法檢測(cè)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組外周組織的α-SMA、MHC、CNN1、Sox10、Sox17表達(dá)，計(jì)算陽性細(xì)胞率，Verhoeff's彈力蛋白染色檢測(cè)第4周時(shí)TEVG外周組織彈力蛋白和膠原蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:1.體外試驗(yàn):細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)除肝素

14、-SDF-1α組外，肝素組和對(duì)照并無α-SMA陽性表達(dá)細(xì)胞生長。1周細(xì)胞僅表達(dá)α-SMA，而CNN1和MHC均為陰性表達(dá)，4周細(xì)胞表達(dá)α-SMA同時(shí)CNN1和MHC表達(dá)大幅增高，Real-time PCR的結(jié)果顯示隨著時(shí)間推移細(xì)胞的α-SMA和CNN1的mRNA的表達(dá)逐漸增加，統(tǒng)計(jì)分析具有顯著差異P＜0.01。2.體外試驗(yàn):1周TEVG外層組織SDF-1α組α-SMA的陽性細(xì)胞率為87.2±5.1％(n=3)，明顯高于肝素組64.2±4

15、.2％(n=3)和對(duì)照組46.2±3.7％(n=3)，統(tǒng)計(jì)有顯著差異P＜0.05，4周時(shí)肝素-SDF-1α組CNN1和MHC的陽性細(xì)胞率為89.7±4.9％(n=5)高于肝素組72.3±3.4％(n=4)和對(duì)照組31.2±2.7％(n=3)，統(tǒng)計(jì)有顯著差異P＜0.05。4周外層組織雙染COL1/MHC，分析兩種蛋白表達(dá)我們發(fā)現(xiàn)肝素-SDF-1α組的COL1密度明顯高于對(duì)照組和肝素組，Verhoeff's彈力蛋白染色表面肝素-SDF-1α