骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)建小口徑組織工程化血管的實驗研究.pdf

1、第一部分成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和鑒定目的本實驗擬通過體外細(xì)胞培養(yǎng)的方法，將間充質(zhì)干細(xì)胞自骨髓血中分離出來，并加以純化、鑒定，進(jìn)一步在體外的培養(yǎng)條件下研究其增殖及生長的特性，從而探討為組織工程化血管研究提供種子細(xì)胞的可能性。 方法收集成人骨髓血，采用密度梯度離心和貼壁生長的方式，提取單個核細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)；收集第2～3代(P2～P3)細(xì)胞行流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞抗原表達(dá)(CD34、CD45、CD11a，CD14、KDR、CD105

2、、HLADR)；采用細(xì)胞計數(shù)的方法，繪制原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)細(xì)胞的生長曲線。 結(jié)論1.利用密度梯度離心和貼壁的方法可以獲取較高純度的BMMSCs；2.該BMMSCs具有大量增殖的功能，可滿足組織工程種子細(xì)胞的需要；3.BMMSCs表達(dá)CD105、KDR，不表達(dá)HLA-DR、CD34、CD45、CD11a、CD14。 第二部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向誘導(dǎo)為血管平滑肌樣細(xì)胞、內(nèi)皮樣細(xì)胞的實驗研究目的本實驗通過誘導(dǎo)動物骨髓

3、間充質(zhì)干細(xì)胞向血管平滑肌樣細(xì)胞和血管內(nèi)皮樣細(xì)胞分化，通過形態(tài)學(xué)和相關(guān)抗原的鑒定，探討其作為血管壁種子細(xì)胞的可行性。 方法通過骨髓穿刺的方法獲取動物骨髓，采用密度梯度離心和貼壁生長的方式，提取單個核細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)；取第2～4代(P2～P4)生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，用含10-8mol/LAT-RA、0.5×10-3mol/Ldb-cAMP的DMEM-LG(15％FBS)培養(yǎng)液誘導(dǎo)、分化為血管平滑肌樣細(xì)胞；用含10ng/mLVEGF的培

4、養(yǎng)液誘導(dǎo)、分化為血管內(nèi)皮樣細(xì)胞；對所誘導(dǎo)、分化的細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和相關(guān)抗原的免疫熒光鑒定。 結(jié)論1.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以在體外定向分化為具有平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞特性的細(xì)胞；2.所誘導(dǎo)的細(xì)胞可作為組織工程的種子細(xì)胞。 第三部分平滑肌樣細(xì)胞和膠原包埋PGA支架組織相容性的實驗研究目的本研究利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞所誘導(dǎo)的平滑肌樣細(xì)胞種植在膠原包埋PGA支架的膜片上，進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和細(xì)胞粘附、增殖的測定，進(jìn)一步評價

5、其組織相容性。 方法利用SD大鼠提取鼠尾膠原，包埋PGA構(gòu)建復(fù)合支架；利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)血管平滑肌樣細(xì)胞；將單純PGA支架、膠原包埋的PGA支架用打孔器將其制作為直徑為6mm的小圓片，鋪于96孔板的板底。實驗分為膠原包埋PGA組、PGA組、單純細(xì)胞組和空白對照組。種植平滑肌樣細(xì)胞，分別進(jìn)行HE染色、甲苯胺藍(lán)染色、電鏡掃描和MTT法檢測，評價平滑肌樣細(xì)胞和膠原包埋PGA的組織相容性。 結(jié)論1.細(xì)胞在膠原包埋PGA的支

6、架上生長良好；2.甲苯胺藍(lán)染色和MTT法可間接反映細(xì)胞在支架上的生長狀態(tài)；3.HE染色和電鏡觀察結(jié)果可供參考。 第四部分體外構(gòu)建初級組織工程小口徑血管、體內(nèi)植入血管壁強化目的本實驗采用在動物體外構(gòu)建初級組織工程化血管、體內(nèi)強化的方法，探討組織工程技術(shù)構(gòu)建小口徑組織工程化血管的可能性，為進(jìn)一步在具有免疫力的高等動物體內(nèi)構(gòu)建組織工程化血管組織并用其修復(fù)血管提供參考。 方法Brdu標(biāo)記所有種子細(xì)胞，DAPI標(biāo)記內(nèi)皮樣細(xì)

7、胞，觀察細(xì)胞標(biāo)記的成功率；血管平滑肌樣細(xì)胞和血管內(nèi)皮樣細(xì)胞分層種植于膠原包埋PGA的復(fù)合支架表面；將細(xì)胞和支架的復(fù)合體種植于動物皮下，并設(shè)立對照組，分別于植入后的第4、6、8周再次麻醉動物，取出植入皮下的組織工程化血管，行組織學(xué)檢查及免疫熒光檢查等。 結(jié)論1.體外構(gòu)建的初級組織工程化血管，以動物的皮下為生物反應(yīng)器，采用靜態(tài)培養(yǎng)的方式可使血管壁得以強化，從而構(gòu)建出次級組織工程化血管；2.組織工程技術(shù)構(gòu)建的次級工程化血管組織其大體結(jié)

8、構(gòu)和與天然血管相似；3.血管壁細(xì)胞有所種植的種子細(xì)胞生長，并參與了組織工程化血管的重構(gòu)。 第五部分組織工程化血管在活體移植的動物實驗?zāi)康谋緦嶒炌ㄟ^體外構(gòu)建、體內(nèi)培養(yǎng)的方法構(gòu)建組織工程化血管，并將其植入動物的股動脈，研究利用小口徑組織工程化血管進(jìn)行血管移植的可能性。 方法構(gòu)建組織工程化血管的方法同前；麻醉實驗動物(為細(xì)胞的供體動物)，暴露股動脈，肝素鈉1mg/kg體重血管內(nèi)注射抗凝，切除長約3cm的一段股動脈，移

9、植組織工程化血管，分別于植入后1w、2w再次麻醉動物，取出移植的血管，行HE染色及免疫熒光等相關(guān)檢查，了解移植后血管的特點及細(xì)胞來源。同時設(shè)對照組，其移植物為單純支架組在皮下培養(yǎng)所形成的管狀結(jié)構(gòu)。 結(jié)論1.利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化而來的種子細(xì)胞和膠原包埋的PGA支架可以構(gòu)建組織工程化小口徑血管，而且可以移植入動物體內(nèi)；2.病理和免疫熒光檢查表明，該血管結(jié)構(gòu)和正常的血管組織結(jié)構(gòu)相似；3.免疫熒光檢查證實，其細(xì)胞來源主要為體外種植的