小葉榕抗炎藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其質(zhì)量控制方法研究.pdf

1、小葉榕葉是桑科植物榕屬小葉榕（Ficus microcarpa）的干燥葉子，以水提物干浸膏作為主成分的咳特靈膠囊收載在部頒標(biāo)準(zhǔn)《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》（中藥成方制劑第十四分冊）中，其用于治療哮喘和慢性支氣管炎癥，臨床療效確切，考慮到中藥的多成分和整體作用，應(yīng)用指紋圖譜方法控制中藥提取物中盡量多的成分，但是中藥療效是多個(gè)功能組分的整體表現(xiàn)，是多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的結(jié)果，既不是單一成分作用，也不是多種成分簡單相加。本文研究的質(zhì)量控

2、制模式在化學(xué)成分和藥效研究基礎(chǔ)上，闡明了“成分與藥效之間的關(guān)聯(lián)性”建立中藥中的某一或幾個(gè)有效成分的定性、定量分析方法，從而建立科學(xué)合理的質(zhì)量控制方法，符合中藥現(xiàn)代化的要求。主要研究內(nèi)容：
　　1.采用LPS刺激巨噬細(xì)胞RAW264.7，建立體外的炎癥模型，采用MTT法檢測小葉榕葉水提物及不同極性部位對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞的毒性作用；Griess法分析培養(yǎng)液中NO含量；采用 ELISA法檢測培養(yǎng)液中TNF-α表達(dá)情況。結(jié)果表明L

3、PS刺激RAW264.7巨噬細(xì)胞后，培養(yǎng)液中炎癥介質(zhì)NO和TNF-α含量顯著增加，小葉榕葉水提物及不同極性部位對(duì)上述炎癥介質(zhì)的釋放具有不同程度的抑制作用，小葉榕葉可能通過抑制炎癥介質(zhì)NO和TNF-α釋放而發(fā)揮抗炎作用；綜合比較炎癥介質(zhì)NO和TNF-α釋放大小，可以判斷乙酸乙酯層萃取物和水層萃取物均能抑制相關(guān)因子的釋放，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為下一步小葉榕葉化學(xué)成分提取分離研究提供參考。
　　2.應(yīng)用血清藥物化學(xué)的方法，對(duì)小葉榕入血成分進(jìn)行分析

4、，為小葉榕藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定基礎(chǔ)，建立小葉榕體外指紋圖譜以及大鼠灌胃后含藥血清的HPLC指紋圖譜分析方法；通過對(duì)比體內(nèi)外指紋圖譜，確定入血部位，為下一步進(jìn)行入血成分的分析以及化學(xué)成分的分離縮小分析范圍。結(jié)果表明含藥血清中顯示出7個(gè)入血成分，大致確定其入血部位主要在乙酸乙酯層，入血成分群極性部位的確定為后期的藥效物質(zhì)的研究指明了方向。
　　3.對(duì)小葉榕葉抗炎有效部位的化學(xué)成分進(jìn)行提取分離并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，同時(shí)對(duì)得到的化學(xué)成分進(jìn)行

5、活性篩選和評(píng)價(jià)。采用硅膠柱層析對(duì)有效部位的成分進(jìn)行分離純化，利用IR、1H-NMR、13C-NMR等技術(shù)對(duì)單體化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。采用LPS刺激巨噬細(xì)胞RAW264.7來建立體外炎癥反應(yīng)模型，運(yùn)用MTT法檢測各單體化合物對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞的毒性作用；Griess法分析培養(yǎng)液中NO量；采用ELISA法檢測培養(yǎng)液中TNF-α表達(dá)情況。結(jié)果得到10個(gè)化合物，通過各單體成分對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子NO和TNF-α

6、的表達(dá)情況，與模型組比較，藥效試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小葉榕發(fā)揮抗炎藥效的作用可能是多成分、多指標(biāo)協(xié)同作用的結(jié)果，該結(jié)果為進(jìn)一步揭示小葉榕抗炎藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供可靠地理論指導(dǎo)和數(shù)據(jù)支撐。
　　4.研究不同采收期小葉榕葉的指紋圖譜，為鑒定小葉榕藥材提供依據(jù)，此外，也為確定最佳采收期提供參考。以29號(hào)峰對(duì)羥基苯甲酸仲丁酯作為參照峰將指紋圖譜分為高極性和低極性兩部分進(jìn)行表達(dá)。利用高效液相色譜法測定不同采收期的12個(gè)樣品的色譜圖譜，在測定的12批藥材中，總

7、共有約55個(gè)色譜峰，其中圖譜顯示有44個(gè)峰為12批樣品所共有，確定為特征指紋峰。同時(shí)，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件將12批藥材中的44個(gè)共有峰與藥效數(shù)據(jù)NO和TNF-α的抑制率進(jìn)行相關(guān)分析和回歸分析，最終找到發(fā)揮藥效的體外成分群，以助于小葉榕水提物體外質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定。
　　5.在統(tǒng)一的色譜條件下，得到12批小葉榕葉有效部位體外色譜指紋圖譜，并獲得12批色譜數(shù)據(jù)，用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件把分別將NO和TNF-α的藥效數(shù)據(jù)與體外小葉榕葉水提物有效部位色