基于介孔二氧化硅雙模態(tài)多功能探針的制備及成像研究.pdf

1、研究背景和意義：膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的原發(fā)性腫瘤，其發(fā)病率高，預(yù)后差。膠質(zhì)瘤中約80％的病變?yōu)閻盒裕饕z質(zhì)母細(xì)胞瘤和間變性膠質(zhì)瘤。雖然近年來(lái)出現(xiàn)了以手術(shù)為主，聯(lián)合放療、化療的綜合治療方案，和一些針對(duì)腫瘤血管新生的靶向治療藥物，但惡性膠質(zhì)瘤患者的5年生存率仍然沒(méi)有得到顯著改善。部分膠質(zhì)瘤患者在接受治療后還出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)進(jìn)展、惡性程度增高的現(xiàn)象。這主要是因?yàn)閻盒阅z質(zhì)瘤特別是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，腫瘤細(xì)胞沿神經(jīng)纖維和毛細(xì)血管侵犯

2、生長(zhǎng)，與正常腦組織、神經(jīng)纖維和血管分界不清，手術(shù)難以徹底切除。此外，手術(shù)和放療區(qū)域大量增生的神經(jīng)膠質(zhì)，也給殘留和復(fù)發(fā)腫瘤組織的檢測(cè)帶來(lái)了很大困難。因此對(duì)膠質(zhì)瘤進(jìn)行非侵入性的早期診斷、準(zhǔn)確定位和邊界顯示，并區(qū)分正常腦組織、腫瘤和增生的神經(jīng)膠質(zhì)，對(duì)治療和預(yù)后具有十分重要的意義。目前膠質(zhì)瘤的診斷主要依靠影像學(xué)手段，特別是磁共振和核素掃描。但磁共振和核素檢查對(duì)體積較小、血腦屏障破壞較輕的腫瘤檢測(cè)的敏感度和特異度較低。如何在提供詳細(xì)解剖學(xué)細(xì)節(jié)的基

3、礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)對(duì)膠質(zhì)瘤高敏感度、高特異度的非侵入性的顯像，成為全世界范圍內(nèi)研究人員和醫(yī)務(wù)工作者面臨的巨大挑戰(zhàn)。
　　 隨著科技的進(jìn)步和生命科學(xué)的發(fā)展，在最近幾十年出現(xiàn)了以能夠在活體狀態(tài)下利用影像學(xué)方法在細(xì)胞和分子水平上研究生物體內(nèi)生化進(jìn)程為目標(biāo)的新興學(xué)科——分子影像學(xué)(MI)。MI的最顯著特點(diǎn)是借助各種分子探針，利用磁共振(MRI)、光學(xué)、核素和超聲等影像學(xué)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)細(xì)胞、乃至單個(gè)分子的非侵入性顯像。作為生命科學(xué)研究的有力工具，

4、分子影像自誕生之初就廣泛應(yīng)用于重大疾病研究、藥物研發(fā)、干細(xì)胞治療（示蹤）等生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，并發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。而作為MI最為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，分子成像探針的研發(fā)也一直處于分子影像研究的最前沿，并取得了令人矚目的成就。
　　 然而，隨著生命科學(xué)研究的不斷深入，單純依靠一種成像方法已經(jīng)不能滿足人們對(duì)MI成像精準(zhǔn)度的要求。因此，將多種成像模式的分子探針進(jìn)行融合，開(kāi)發(fā)能同時(shí)滿足多種成像模式需求的分子探針成為了廣大分子影像研究工作者關(guān)注

5、的焦點(diǎn)。在MI傳統(tǒng)的成像方法中，MRI和光學(xué)成像以其無(wú)創(chuàng)、實(shí)時(shí)、無(wú)X線電離輻射和可重復(fù)性高等優(yōu)勢(shì)一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)，也是最具發(fā)展前景的成像手段。MRI和光學(xué)探針的融合，不僅可以提高探針的敏感度，而且能夠提供靶器官詳細(xì)的軟組織解剖細(xì)節(jié)，滿足早期、動(dòng)態(tài)、實(shí)時(shí)、無(wú)創(chuàng)和精準(zhǔn)成像的要求。
　　 在本項(xiàng)目中針對(duì)當(dāng)前膠質(zhì)瘤研究的熱點(diǎn)問(wèn)題，利用具備良好生物相容性的介孔二氧化硅(MSNs)材料、有機(jī)近紅外熒光染料(IR-808)和磁共振含

6、釓對(duì)比劑(Gd-DTPA)構(gòu)建具有近紅外(NIR)光學(xué)和磁共振雙模態(tài)成像功能的分子探針，并建立人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤皮下腫瘤模型，探討所構(gòu)建分子探針的穩(wěn)定性、靶向成像的效果和生物相容性。以期通過(guò)構(gòu)建的雙模態(tài)成像分子探針，為膠質(zhì)瘤的早期診斷提供新的技術(shù)支持。
　　 研究目的：
　　 一、探討近紅外花菁類(lèi)染料IR-808對(duì)膠質(zhì)瘤、乳腺癌等惡性腫瘤靶向成像的可行性，并對(duì)IR-808的生物相容性進(jìn)行研究，為后期雙模態(tài)成像探針的構(gòu)建尋找合

7、適的NIR光學(xué)成像探針;
　　 二、構(gòu)建具有良好單分散性、高比表面、規(guī)則孔道結(jié)構(gòu)和生物相容性的介孔二氧化硅納米材料，為進(jìn)一步構(gòu)建具有MRI和NIR雙模態(tài)成像的分子探針提供生物納米材料載體;
　　 三、構(gòu)建具有良好水溶性、生物相容性的MRI和NIR多功能雙模態(tài)成像探針，并檢驗(yàn)其在體外和活體組織內(nèi)成像的可行性;
　　 四、探討所構(gòu)建的多功能雙模態(tài)探針對(duì)人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(U87-MG)裸鼠模型成像的可行性及其應(yīng)用價(jià)值。<

8、br>　　 研究方法、內(nèi)容和結(jié)果
　　 一、近紅外花菁類(lèi)染料IR-808對(duì)膠質(zhì)瘤的靶向性光學(xué)成像研究
　　 1、腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)和標(biāo)記C6細(xì)胞的培養(yǎng)采用含胎牛血清(15％)、馬血清(2.5％)和1％雙抗（100U/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素）的F12 Kaighn's培養(yǎng)基，人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U87-MG和人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的培養(yǎng)采用含10％胎牛血清和1％雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基;所有細(xì)胞均在細(xì)胞培養(yǎng)

9、箱內(nèi)以37攝氏度(℃)、5％ CO2及飽和濕度條件下的連續(xù)培養(yǎng)傳代，所有細(xì)胞均貼壁生長(zhǎng)。24孔板每孔中加入1μlIR-808溶液(10mM)在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育10-15 min。多聚甲醛固定后，進(jìn)行DAPI染色。熒光倒置相差顯微鏡觀察顯示:IR-808在體外顯示出對(duì)大鼠膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞、人膠質(zhì)母細(xì)胞U87-MG均具有良好的靶向性;熒光顯微鏡照片顯示，IR-808均勻分布于C6、U87-MG和MDA-MB-231細(xì)胞體內(nèi)，胞核未見(jiàn)近紅

10、外熒光染色;而人胚腎細(xì)胞HEK293T胞體呈微弱近紅外熒光。
　　 2、IR-808的細(xì)胞毒性試驗(yàn)人胚腎細(xì)胞HEK293T采用含10％胎牛血清和1％雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基;在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)以37℃、5％ CO2及飽和濕度條件下的連續(xù)培養(yǎng)傳代，HEK293T細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。MTT法計(jì)算IR-808的細(xì)胞毒性表明正常劑量濃度(20μmol/L)的IR808溶液在共孵育48h時(shí)對(duì)人胚腎細(xì)胞HEK293T的生長(zhǎng)無(wú)明顯影響，2倍于正常濃度的

11、IR808溶液在48h后明顯降低了HEK293T細(xì)胞的增殖。
　　 3、近紅外花菁類(lèi)染料IR-808靶向MDA-MB-231乳腺癌和C6膠質(zhì)瘤的活體實(shí)驗(yàn)當(dāng)裸鼠皮下腫瘤直徑達(dá)約0.5cm時(shí)，經(jīng)尾靜脈注射200μl IR-808溶液(0.05mM)。24h后進(jìn)行光學(xué)成像檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)為778nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為808nm。
　　 乳腺癌腫瘤部位有較明顯的近紅外熒光信號(hào)，且具有良好的背景噪聲比。將腫瘤組織完整切除后，體外近紅外熒

12、光成像也顯示出較高的近紅外信號(hào)。
　　 BALB/C裸小鼠膠質(zhì)瘤原位模型活體近紅外熒光成像顯示腫瘤接種部位有較強(qiáng)的熒光信號(hào)，熒光強(qiáng)度可以穿透裸小鼠的顱骨;而SD大鼠活體不能觀察到光學(xué)信號(hào)。處死動(dòng)物進(jìn)行腦組織體外成像時(shí)，見(jiàn)BALB/C裸小鼠和SD大鼠腦組織腫瘤組織均有較強(qiáng)的近紅外熒光。
　　 二、基于帶氨基介孔二氧化硅納米顆粒磁共振和光學(xué)雙模態(tài)探針的制備
　　 1、介孔二氧化硅納米顆粒的制備和表征根據(jù)參考文獻(xiàn)的方法

13、，0.4g十六烷基三甲基溴化銨溶于567.5ml去離子水中，加入3.52ml乙酸乙酯和12.12ml氨水，加入0.9ml正硅酸四乙脂和1.1ml（3-氨丙基）三乙氧基硅烷。將混合液在室溫下以300轉(zhuǎn)/分(rpm)充分?jǐn)嚢璺磻?yīng)24小時(shí)(h)。去離子水清洗3次，無(wú)水乙醇清洗1次。在樣品中加入120 ml無(wú)水乙醇和240μl濃鹽酸，在60攝氏度水浴鍋中攪拌反應(yīng)3h。去離子水清洗3次，定容至5ml。
　　 場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡的照片使用

14、Hitachi S4800型掃描電子顯微鏡拍攝，加速電壓為1kV。透射電子顯微鏡(TEM)的照片使用日本JEOL公司JEM-2100型透射電子顯微鏡拍攝，加速電壓為200kV。通過(guò)測(cè)量約100個(gè)納米顆粒的直徑，計(jì)算得到MSNs-NH2的平均粒徑為120nm(60～160 nm)。氮?dú)馕?脫附等溫線使用北京金埃譜科技有限公司V-Sorb2800P比表面積及孔徑分析儀在-196℃測(cè)試，測(cè)試前將樣品在13，200rpm離心10min后，在7

15、0℃烘箱內(nèi)徹底干燥，研磨成均勻粉末狀，并在180℃條件下脫氣6小時(shí)。采用Brunauer-Emmett-Teller(BET)方法在吸附曲線p/p0=0.05～0.15處計(jì)算樣品的比表面積為～473m2/g;采用Barrett-Joyner-Halenda(BJH)分析法基于吸附數(shù)據(jù)計(jì)算MSNs-NH2的孔徑為3nm。介孔二氧化硅材料的傅立葉變換紅外光譜使用美國(guó)Thermo Nicolet公司NEXUS870型傅立葉紅外光譜儀測(cè)定。元素

16、分析使用德國(guó)Elementar公司Vario MICRO型元素分析儀表明MSNs-NH2的質(zhì)量百分含量為2.67％。使用英國(guó)Malvern公司Nano-Z型Zeta電位儀分析定容后MSNs-NH2的Zeta電位為+32mV。
　　 2、MSNs-Gd/NIR雙模態(tài)成像分子探針的構(gòu)建和表征0.7mg近紅外花菁類(lèi)染料IR-808和4ml0.1摩爾每升的Gd-DTPA溶液加入20mlMES緩沖液(0.1M)中;加入N-羥基琥珀酰亞胺磺

17、酸鈉鹽0.4mg，室溫下避光攪拌2h;然后加入1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽0.6mg，室溫下避光攪拌活化反應(yīng)3～4 h。加入1ml介孔二氧化硅溶液，避光反應(yīng)過(guò)夜。
　　 使用美國(guó)Thermo Nicolet公司NEXUS870傅立葉紅外光譜儀分析介孔二氧化硅修飾IR-808和Gd-DTPA前后的近紅外光譜。紫外-可見(jiàn)吸收光譜檢測(cè)表明IR-808與MSNs-NH2的連接系數(shù)為0.3％;美國(guó)PE公司OPTIMA53

18、00DV型電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀ICP顯示MSNs-Gd/NIR中釓的濃度為0.009M;不同濃度梯度Gd MR成像結(jié)果顯示MSNs-Gd/NIR比市售的Gd-DTPA具有更高的弛豫率，能更加顯著的縮短T1弛豫時(shí)間。使用英國(guó)Malvern公司Nano-Z型Zeta電位儀分析定容后MSNs-Gd/NIR的Zeta電位為+7.35mV.
　　 3、MSNs-Gd/NIR的細(xì)胞毒性試驗(yàn)人胚腎細(xì)胞HEK293T采用含10％胎牛血清和

19、1％雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基;在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)以37℃、5％ CO2及飽和濕度條件下的連續(xù)培養(yǎng)傳代。MTT檢測(cè)MSNs-Gd/NIR對(duì)HEK293T細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)明顯抑制作用。
　　 三、MSNs-Gd/NIR靶向人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87-MG的體外細(xì)胞及荷瘤裸鼠活體試驗(yàn)研究
　　 1、腫瘤細(xì)胞對(duì)MSNs-Gd/NIR的攝取吸取100μl前面所制備的MSNs-Gd/NIR溶液(50mg/ml)，13，000rpm離心10min后

20、，加入1ml DMEM培養(yǎng)基，超聲充分溶解后，分別取20μl加入24孔板內(nèi)，每孔MSNs-Gd/NIR的終濃度為100μg/ml。在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2～3 h。使用PBS清洗細(xì)胞3次，每孔加入300μl多聚甲醛固定30min; PBS再次清洗細(xì)胞3次;每孔加入300μl DAPI溶液孵育20min。棄去染色液，PBS清洗1次，在載玻片上滴加1滴甘油，將蓋玻片倒扣于載玻片上，指甲油封片。使用Olympus熒光倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞的

21、染色情況。結(jié)果表明C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞和U87-MG-GFP細(xì)胞內(nèi)均有較強(qiáng)的近紅外熒光。
　　 2、大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6的MRI和NIR體外成像在C6細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入一定量的MSNs-Gd/NIR（終濃度為200μg/ml），對(duì)照組C6細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入同等量的DMEM培養(yǎng)基;兩組細(xì)胞均在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4h后，進(jìn)行MRI和NIR光學(xué)成像。結(jié)果顯示MSNs-Gd/NIR組C6細(xì)胞的TI值明顯低于對(duì)照組。
　　 3、MSN

22、s-Gd/NIR靶向膠質(zhì)瘤的活體實(shí)驗(yàn)在人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87-MG裸鼠皮下腫瘤模型建立成功后，向腫瘤內(nèi)注射50μl MSNs-Gd/NIR溶液(5mg/ml)，分別在注射后0、1、4、8、12、24和48h后分別行MR和近紅外光學(xué)檢查，在48h后脫頸處死動(dòng)物，并取腫瘤組織和各重要臟器進(jìn)行近紅外熒光成像。
　　 MRI掃描用德國(guó)SIMENS公司MAGNETOM Trio3.0 T磁共振掃描儀和定制小動(dòng)物線圈（4通道）;掃描具體參數(shù)如

23、下:橫斷位T1WI，TR=670ms，TE=11ms,Average=4,Slice Thickness:2.0mm,FOV=60mm,Flip Angle=150;T2WI, TR=3100ms, TE=98ms,Average=4,Slice Thickness:2.0mm,FOV=60mm,Flip Angle=120;T1Map: TR=15.0ms, TE=1.73ms, Average=2, Slice Thickness:

24、2.0mm，F(xiàn)OV=113mm，F(xiàn)lip Angle=5，26。小動(dòng)物活體成像儀光學(xué)檢查使用美國(guó)Xenogen公司的IVIS Lumina XR系統(tǒng)，激發(fā)波長(zhǎng)為778nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為808nm。
　　 在腫瘤內(nèi)注射50μl MSNs-Gd/NIR溶液(5mg/ml)后，近紅外熒光和MR動(dòng)態(tài)觀察腫瘤信號(hào)的改變。在瘤內(nèi)注射48小時(shí)，腫瘤內(nèi)仍然能夠觀察到明顯的近紅外熒光信號(hào)，在MR T1 WI上腫瘤內(nèi)部可以觀察到稍高于正常腫瘤組織的

25、信號(hào)，范圍較前擴(kuò)大。在完成MR和NIR熒光掃描后，處死動(dòng)物。取心、腦、肺、肝臟、脾臟、腎臟、小腸和皮膚進(jìn)行近紅外熒光檢測(cè)，結(jié)果顯示:腫瘤組織內(nèi)有較為均勻的近紅外熒光顯示。
　　 研究結(jié)論：
　　 1、近紅外花菁類(lèi)染料IR-808具有靶向膠質(zhì)瘤的作用，且具有良好的生物相容性，有望作為膠質(zhì)瘤近紅外光學(xué)成像的分子探針。
　　 2、所制備的帶氨基的介孔二氧化硅材料具有較大的比表面積、規(guī)則的孔道、良好的單分散性和水溶性，有

26、望作為構(gòu)建多模態(tài)成像和診斷治療學(xué)探針的載體。
　　 3、所構(gòu)建的近紅外光學(xué)和磁共振雙模態(tài)分子探針MSNs-Gd/NIR具有穩(wěn)定的光學(xué)量子輸出和顯著的T1弛豫率，生物相容性良好，且非特異性的靶向膠質(zhì)瘤。有望作為膠質(zhì)瘤研究的多模態(tài)成像工具，用于腫瘤的早期診斷和藥物療效監(jiān)測(cè)。
　　 研究的主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)1、有學(xué)者發(fā)現(xiàn)新型近紅外花菁類(lèi)染料IR-808能夠?qū)Ψ伟?、宮頸癌等多種上皮組織來(lái)源的惡性腫瘤進(jìn)行靶向NIR成像，但目前尚未見(jiàn)有利用

27、IR-808對(duì)膠質(zhì)瘤進(jìn)行成像研究的報(bào)道。本項(xiàng)目率先將IR-808應(yīng)用于BABL/c裸小鼠原位膠質(zhì)瘤的光學(xué)成像研究，發(fā)現(xiàn)IR-808的NIR信號(hào)可以穿透BABL/c裸小鼠的顱骨，實(shí)現(xiàn)原位膠質(zhì)瘤的非侵入性NIR成像，顯示了良好的研究和應(yīng)用前景。
　　 2、以往雖然有文獻(xiàn)報(bào)道利用有機(jī)染料和含釓對(duì)比劑制備MRI/NIR雙模態(tài)納米探針，但其探針的載體制備方法較為繁瑣。本項(xiàng)目制備了表面帶有大量氨基的介孔二氧化硅納米顆粒，無(wú)需表面修飾即可通過(guò)