RNA干擾抑制NCAM140表達(dá)對(duì)GDNF保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元作用的影響.pdf

1、目的：設(shè)計(jì)、篩選針對(duì)小鼠NCAM140基因的有效RNA干擾序列，構(gòu)建干擾質(zhì)粒抑制NCAM140基因表達(dá)，同時(shí)研究NCAM140基因表達(dá)降低后對(duì)GDNF介導(dǎo)的MN9D細(xì)胞的突起生長(zhǎng)的影響。
　　方法：1）使用基因序列軟件設(shè)計(jì)、篩選符合公開文獻(xiàn)篩選參數(shù)的4條靶序列以及1條陰性對(duì)照序列，由上海吉瑪技術(shù)有限公司合成。與載體質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo重組后，分別命名為pSi-nca1、pSi-nca2、pSi-nca3、pSi-nca4

2、和pSi-control。轉(zhuǎn)染大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。選擇陽性克隆進(jìn)行DNA測(cè)序鑒定，Western blot方法進(jìn)行干擾靶點(diǎn)的篩選。選取干擾效率最高的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MN9D細(xì)胞，普通光學(xué)顯微鏡分別計(jì)數(shù)同一視野細(xì)胞總數(shù)及GFP陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。2）篩選的NCAM140有效干擾質(zhì)粒pSi-nca4轉(zhuǎn)染6-OHDA損傷(200μM)后的MN9D細(xì)胞，光鏡下測(cè)量細(xì)胞突起長(zhǎng)度實(shí)驗(yàn)分組為:空白組、pSi-control組、pSi-nca4組、空白+

3、GDNF組、pSi-control+GDNF組、pSi-nca4+GDNF組;共聚焦顯微鏡測(cè)量轉(zhuǎn)染后細(xì)胞突起長(zhǎng)度的實(shí)驗(yàn)分組為:pSi-control組、pSi-nca4組、pSi-control+GDNF組、pSi-nca4+GDNF;按上述分組，GDNF處理組為GDNF(50ng/ml)持續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，應(yīng)用IPP(Image ProPlus)軟件測(cè)定細(xì)胞突起長(zhǎng)度。
　　結(jié)果：DNA測(cè)序結(jié)果顯示重組質(zhì)粒中含有所設(shè)計(jì)的寡核苷酸雙鏈

4、，且序列正確。轉(zhuǎn)染24后，pSi-nca4組NCAM140的蛋白質(zhì)表達(dá)水平較陰性對(duì)照組顯著下降(P＜0.05)，提示pSi-caa4為干擾效率最高。光鏡下計(jì)算pSi-nca4的轉(zhuǎn)染效率為62％，光鏡下細(xì)胞突起長(zhǎng)度的析因分析結(jié)果顯示，GDNF的主效應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=16.503，P＜0.0001)，pSi-nca4的干擾效應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.835，P=0.036)，GDNF和pSi-nca4的交互作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.527，

5、P=0.045);空白組與空白+GDNF組的細(xì)胞突起長(zhǎng)度值分別為:51.66±2.09μm，57.17±2.78μm，(P＜0.05）;GDNF作用下，pSi-control組、pSi-nca4組細(xì)胞突起長(zhǎng)度分別為:56.89±3.43μm，51.82±2.33μm(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;共聚焦顯微鏡下測(cè)得細(xì)胞突起長(zhǎng)度數(shù)值的析因分析結(jié)果顯示:GDNF的主效應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.665，P=0.030)，pSi-nca4的干

6、擾效應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.870，P=0.028)，GDNF和pSi-nca4的交互作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.473，P=0.033);pSi-control與pSi-control+GDNF組的細(xì)胞突起長(zhǎng)度值分別為49.43±2.71μm，58.48±5.79μm差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，pSi-nca4+GDNF組細(xì)胞突起長(zhǎng)度為49.35±3.54μm，較pSi-control+GDNF組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論