螺旋藻多糖對MPTP誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用.pdf

1、帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種以黑質(zhì)中多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元變性壞死為主要病理特征的退行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。最近研究表明DA氧化分解過程中氧自由基的大量釋放，線粒體呼吸功能的損傷是PD發(fā)病過程中造成神經(jīng)元損傷的重要的環(huán)節(jié)。 1-甲基-4-苯基-1，2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahyrdropyridine，MPTP)在嚙齒類和靈長類動(dòng)

2、物均可建立類似人類PD的模型。MPTP的神經(jīng)毒性作用依賴于單胺氧化酶B(monoamineoxidase，MAO-B)將其轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基-4-苯基吡啶離子(1-methyl-4-phenylpyridium，MPP<'+>)，后者被選擇性攝取并濃集于線粒體內(nèi)，抑制了電子傳遞鏈中復(fù)合物Ⅰ的功能，導(dǎo)致氧自由基產(chǎn)生增多，線粒體膜電位損傷，能量產(chǎn)生障礙，最終導(dǎo)致DA能神經(jīng)元壞死。MPP<'+>還可促進(jìn)DA外流，增加DA的自身氧化以及由此造成的氧

3、化損傷。因此，能夠增強(qiáng)內(nèi)源性清除自由基系統(tǒng)功能且能減少DA代謝率的藥物將成為一種新的PD治療策略。 多糖是生物體內(nèi)除蛋白質(zhì)和核酸外又一類重要的生物大分子，它在控制細(xì)胞的分裂分化，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長，延緩衰老，維持代謝等方面發(fā)揮著重要的作用。螺旋藻多糖(P0lysaccharide from Spirulina Platensis，PSP)是從海洋植物螺旋藻中提取的一種酸性雜多糖，已有實(shí)驗(yàn)證明PSP具有抗衰老，抗輻射損傷，抗腫瘤，增強(qiáng)

4、免疫力，抗氧化等多種生物活性，然而有關(guān)其對PD的防治作用及對DA能神經(jīng)元的保護(hù)作用尚未見報(bào)道。本研究在C57BL/6J特種小鼠，用MPTP腹腔注射造成黑質(zhì)DA能神經(jīng)元損傷，制備的小鼠PD模型上，應(yīng)用免疫組織化學(xué)、分子生物學(xué)、高效液相電化學(xué)檢測(high performance liquid chromatography-electrochemical detection，HPLC-ECD)等多項(xiàng)研究技術(shù)觀察了PSP對MPTP損傷的小鼠黑

5、質(zhì)中DA能神經(jīng)元的保護(hù)作用；檢測了小鼠紋狀體內(nèi)DA及其代謝產(chǎn)物的含量；并初步探討了PSP對MPTP造成小鼠DA能神經(jīng)元損傷的抗氧化保護(hù)作用；在MPP<'+>造成的DA能MES 23.5細(xì)胞損傷模型，采用甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)，流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)和激光掃描共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscope，LSCM)

6、方法，測定了PSP對細(xì)胞存活率，細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平，線粒體膜電位，和細(xì)胞內(nèi)鈣水平的變化的影響，研究TPSP對DA能神經(jīng)元的保護(hù)作用機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明： 1.MPTP損傷的小鼠黑質(zhì)中酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)和多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(dopamine transporter,DAT)免疫反應(yīng)陽性表達(dá)減少(P<0.01)，PSP 800 mg

7、/kg預(yù)處理組與MPTP組相比，黑質(zhì)中TH和DAT免疫組化陽性表達(dá)明顯增加(P<0.01)。 2.MPTP損傷的小鼠黑質(zhì)中TH和DAT mRNA表達(dá)明顯減少(P<0.01)，PSP800mg/kg預(yù)處理組與MPTP組相比，TH和DAT mRNA表達(dá)明顯增多(P<0.01)。 3.MPTP損傷的小鼠紋狀體中，DA及其代謝產(chǎn)物二羥基苯乙酸(3，4-dihydroxyphenyl acetic acid，DOPAC)和高香草酸

8、(homovanilic acid，HVA)含量降低(P<0.01)；DA代謝率(DOPAC+HVA/DA)明顯升高(P<0.01)。PSP800 mg/kg預(yù)處理組與MPTP組相比，紋狀體中DA，DOPAC和HVA含量升高，DA代謝率明顯降低(P<0.01)。提示PSP對MPTP造成的黑質(zhì)DA能神經(jīng)元損傷有明顯保護(hù)作用。 4.測定小鼠血漿和腦組織中MAO-B的活性，結(jié)果顯示MAO-B抑制劑司立吉林預(yù)處理組小鼠血漿和腦組織中MA

9、O-B活性明顯降低(p<0.01)，MPTP組和PSP預(yù)處理組小鼠血漿和腦組織中MAO-B活性均無明顯差異。 5.測定小鼠血漿和腦組織中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)，谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)的活性。MPTP損傷的小鼠血漿和腦組織中SOD，GSH-Px活性與正常組相比明顯降低(P<0.01)，PSP和司立吉林預(yù)處理組與MPTP組相比，SO

10、D，GSH-Px活性明顯升高(P<0.01)。提示PSP對MPTP造成DA能神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用與其抑制MAO-B作用無關(guān)，而與其提高了清除自由基能力，減少氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。 6.MTF法檢測DA能細(xì)胞株MES23.5細(xì)胞存活率的結(jié)果顯示：細(xì)胞相對存活率隨MPP<'+>濃度增加而逐漸降低，至20μmol/L及以上濃度時(shí)，與對照組比較，有顯著差異(p<0.01)。經(jīng)不同濃度的PSP預(yù)處理后，測定對20μmol/L的MPP<'+>組細(xì)

11、胞存活率的影響，40 mg/L及以上濃度的PSP預(yù)處理的細(xì)胞相對存活率均高于MPP<'+>組。 7.FCM檢測△Ψm發(fā)現(xiàn)，MES 23.5細(xì)胞經(jīng)20μmol/L的MPP<'+>孵育24 h后，28.8％±5.4％的細(xì)胞呈羅丹明123(rhodamine 123，R123)染色陰性，表明28.8％的MES23.5細(xì)胞的△Ψm降低，40 mg/L的PSP處理后，20.1％±3.2％的細(xì)胞呈R 123染色陰性，明顯低于MPP<'+>組

12、(P<0.01)。MPP<'+>組細(xì)胞內(nèi)R123平均熒光強(qiáng)度為30.02±3.5，較正常對照組明顯降低(46.67±5.3)。PSP 40 mg/L處理組平均熒光強(qiáng)度為43.00±4.7，較單獨(dú)使用MPP<'+>組明顯增強(qiáng)(P<0.01)。 8.FCM檢測ROS發(fā)現(xiàn)，20μmol/L的MPP<'+>孵育MES 23.5細(xì)胞24 h后，46.3％±8.6％的細(xì)胞呈DCF染色陽性，明顯高于對照組(30.08％±5.3％)，表明細(xì)胞內(nèi)

13、ROS水平升高，細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。經(jīng)40 mg/L的PSP處理后，35.68％±5.7％的細(xì)胞呈DCF染色陽性，明顯低于MPP<'+>組(p<0.05)。MPP<'+>組細(xì)胞DCF平均熒光強(qiáng)度為64.07±10.6，明顯高于對照組31.8±5.7(P<0.01)；PSP 40 mg/L組，DCF平均熒光強(qiáng)度為38.20±4.2，比單獨(dú)MPP<'+>處理組明顯降低(P<0.01)。 9.LSCM測定細(xì)胞內(nèi)游離Ca<'2+>發(fā)現(xiàn)

14、，20μmol/L的MPP<'+>孵育MES 23.5細(xì)胞24 h后，細(xì)胞內(nèi)Fluo-3熒光強(qiáng)度為160.28±48.99，明顯高于對照組(57.32±13.52)，表明細(xì)胞內(nèi)Ca<'2+>水平升高；經(jīng)40 mg/L的PSP處理后，細(xì)胞內(nèi)Fluo-3熒光強(qiáng)度為83.03±8.22，明顯低于MPP<'+>組(p<0.01)。 上述結(jié)果表明：PSP對MPTP造成的C57BL/6J小鼠黑質(zhì)DA能神經(jīng)元損傷有明顯保護(hù)作用，減少黑質(zhì)中DA

15、能神經(jīng)元的變性壞死，增加了紋狀體中DA及其代謝產(chǎn)物的含量，并且降低了DA的代謝率。該保護(hù)作用并非因MPTP在體內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)镸PP<'+>的量減少，而與PSP提高了清除自由基能力，減少氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。同時(shí)PSP可通過減輕MPP<'+>導(dǎo)致的△Ψm異常，降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平，降低細(xì)胞內(nèi)游離Ca<'2+>水平，從而減輕MPP<'+>對DA能MES 23.5細(xì)胞的損傷。本實(shí)驗(yàn)中研究的PSP對DA能神經(jīng)元的保護(hù)作用以及對其可能機(jī)制的初步探討，為PD