外源多巴胺對α-Synuclein過表達多巴胺能神經(jīng)元的影響.pdf

1、目的:探討外源多巴胺對α-Synuclein過表達多巴胺能神經(jīng)元細胞功能的影響，為闡明“左旋多巴/多巴胺治療是否會加速帕金森病病情進展”提供體外實驗依據(jù)。 方法:（1）構建帕金森病體外細胞模型：利用脂質(zhì)體將野生型α-Synuclein-pcDNA3．1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染多巴胺能細胞系SK-N-SH，通過G418篩選獲得穩(wěn)定克隆，并通過RT-PCR和Western blot鑒定目的基因α-Synuclein在細胞中的轉(zhuǎn)錄和表達水平。（2

2、）觀察過表達α-Synuclein對SK-N-SH細胞功能的影響：分別以α-Synuclein-pcDNA3．1重組質(zhì)粒和pcDNA3．1空載體轉(zhuǎn)染的細胞株作為實驗組和對照組，通過MTT法、比色法、流式細胞術、RT-PCR和Western blot分別比較兩組細胞生長曲線和生長活性、MDA含量、早期凋亡率、凋亡相關基因Caspase-3、P53、Bcl-2、Bax和氧化應激相關基因SOD1、SOD2、CAT的轉(zhuǎn)錄水平及Caspase-3

3、、P53、Bcl-2、Bax的表達水平。（3）觀察添加外源多巴胺對α-Synuclein過表達SK-N-SH細胞功能的影響：以不添加DA的細胞株為對照組，按添加多巴胺的終濃度值將實驗組分為50 uM DA組、100 uM DA組、300 uM DA組和500 uM DA組。通過MTT法、比色法、流式細胞術、RT-PCR和Western blot分別比較各組細胞活性、MDA含量、早期凋亡率、凋亡相關基因Caspase-3、P53、Bcl-

4、2、Bax和氧化應激相關基因SOD1、SOD2、CAT的轉(zhuǎn)錄水平及Caspase-3、P53、Bcl-2、Bax的表達水平。 結(jié)果:（1）帕金森病細胞模型的構建：α-Synuclein-pcDNA3．1重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染SK-N-SH細胞系，通過350 ug/ml的G418篩選獲得陽性克隆，RT-PCR和Western blot結(jié)果表明目的基因α-Synuclein在α-Synuclein-pcDNA3．1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的轉(zhuǎn)錄和表

5、達水平均高于pcDNA3．1空載體轉(zhuǎn)染組，證實穩(wěn)定表達野生型α-Synuclein的細胞模型構建成功。（2）過表達α-Synuclein對SK-N-SH細胞功能的影響：MTT法顯示實驗組較對照組細胞生長緩慢、活性下降；比色法測定吸光度顯示實驗組細胞勻漿MDA含量高于對照組；流式細胞術顯示實驗組細胞早期凋亡率高于對照組；RT-PCR顯示基因Caspase-3、P53、Bax、SOD1、SOD2和CAT在實驗組的轉(zhuǎn)錄水平高于對照組、基因Bc

6、l-2在實驗組的轉(zhuǎn)錄水平低于對照組；Western blot顯示Caspase-3、P53和Bax在實驗組的表達水平高于對照組、Bcl-2在實驗組的表達水平低于對照組。（3）外源多巴胺對α-Synuclein過表達SK-N-SH細胞功能的影響：隨著外源多巴胺添加濃度的遞增，MTT法顯示細胞活性遞減；比色法顯示細胞勻漿MDA含量遞增；流式細胞術顯示細胞早期凋亡率遞增；RT-PCR顯示基因Caspase-3、P53、Bax、SOD1、SOD

7、2和CAT的轉(zhuǎn)錄水平遞增、基因Bcl-2的轉(zhuǎn)錄水平遞減；Western blot顯示Caspase-3、P53和Bax的表達水平遞增、Bcl-2的表達水平遞減。 結(jié)論:（1）過表達野生型α-Synuclein增強SK-N-SH細胞內(nèi)氧化應激水平，加速細胞凋亡。（2）添加外源多巴胺增強α-Synuclein過表達SK-N-SH細胞內(nèi)氧化應激水平，加速細胞凋亡，且這種效應呈劑量依賴性。（3）體外實驗提示應用左旋多巴/多巴胺治療帕金森