sIRNA干擾預(yù)防酒精性股骨頭壞死的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景和目的:
　　 酒精性股骨頭壞死(Osteonecrosis of the femoral head,ONFH)在臨床上常見,早期癥狀隱匿,容易被忽視,當(dāng)髖部疼痛不適就診時(shí),股骨頭病變往往發(fā)展為ARCOⅡ期或Ⅱ期以上,失去了治療的最佳時(shí)期,該病致殘率高,嚴(yán)重威脅著人類的健康,迄今沒有發(fā)現(xiàn)有效預(yù)防該病發(fā)生的方法。最新的酒精性股骨頭壞死發(fā)病機(jī)理動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,過氧化物酶體增殖子活化受體-γ(PPARγ)基因在動(dòng)物股骨頭內(nèi)的多潛能干

2、細(xì)胞骨髓基質(zhì)細(xì)胞(marrow stromal cells,MSCs)成脂分化過程中起著關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用,長(zhǎng)期大量的酒精攝入可明顯上調(diào)PPARγ基因表達(dá),促進(jìn)MSCs成脂分化,抑制其成骨分化,引起股骨頭內(nèi)脂肪細(xì)胞數(shù)目增多、體積增大、脂質(zhì)沉積、骨細(xì)胞變性壞死。本研究運(yùn)用RNA干擾(RNA interference,RNAi)原理,將經(jīng)過篩選、鑒定并體外擴(kuò)增的高效siRNA腺病毒載體注入家兔的股骨頭內(nèi),觀察siRNA腺病毒預(yù)防酒精性O(shè)NFH

3、的效果,從基因方面尋求一種防治酒精性股骨頭壞死的有效途徑。
　　 材料和方法：
　　 選取健康新西蘭種家兔96只,2～3月齡,體重2.7±0.5/只,雌雄不拘,隨機(jī)分為4組,每組24只。正常對(duì)照組(N組):采用灌胃法,給予10％葡萄糖注射液10ml/(kg·d)；酒精組(M組):采用灌胃法,給予白酒(酒精度含量46％V/V)10ml/(kg·d),作為股骨頭壞死模型組；酒精+重組腺病毒組(S組):同法同量灌酒,在實(shí)驗(yàn)第1

4、、3、5月的第1天隨機(jī)選擇側(cè)別麻醉下經(jīng)股骨頸行股骨頭穿刺,注入25μl siRNA腺病毒滴液,用骨蠟封閉穿刺小孔。酒精+穿刺組(CO組):手術(shù)方法同S組,但不注入siRNA腺病毒載體。各組動(dòng)物分別于實(shí)驗(yàn)第2、4、6月月末測(cè)定空腹血清總膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)含量；觀察各組動(dòng)物股骨頭組織學(xué)變化;測(cè)定各組股骨頭組織中的最大脂肪細(xì)胞平均直徑、骨小梁面積分?jǐn)?shù)和空骨陷窩計(jì)數(shù)。采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)各組股骨頭組織中PPARγmRNA和O

5、steocalcin mRNA的表達(dá)。Western-blot檢測(cè)各組股骨頭內(nèi)PPARγ蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.一般狀況:在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間,N組食欲正常,動(dòng)作敏捷,體重逐漸增加；M、CO兩組隨酒精灌胃時(shí)間延長(zhǎng)食欲逐漸下降,活動(dòng)量減小,動(dòng)作遲緩,體重增長(zhǎng)不明顯,精神欠佳,皮毛發(fā)黃、晦澀、失去光澤；S組精神、食欲、體重增長(zhǎng)及動(dòng)作靈活性優(yōu)于M、CO組,但較N組稍差。
　　 2.各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物各時(shí)間段空腹血清甘油

6、三酯(TG)和總膽固醇(CHO)含量變化(mmol/L):實(shí)驗(yàn)第2、4、6個(gè)月M、CO、S組動(dòng)物空腹TG、CHO測(cè)定結(jié)果明顯高于N組水平,且隨實(shí)驗(yàn)進(jìn)展呈逐漸增高趨勢(shì),與N組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；股骨頭組織病理學(xué)HE染色、蘇丹Ⅲ脂肪染色顯示M、CO組股骨頭內(nèi)空骨陷窩計(jì)數(shù)、脂肪細(xì)胞及最大脂肪細(xì)胞平均直徑明顯增多、增大,骨小梁稀疏、變細(xì),相對(duì)N、S組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),S組空骨陷窩計(jì)數(shù)、脂肪細(xì)胞及最大脂肪細(xì)胞平均

7、直徑未見明顯增加(P>0.05),相對(duì)N組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3.股骨頭骨髓細(xì)胞成脂、成骨分化基因檢測(cè)結(jié)果:RT-PCR檢測(cè)股骨頭骨髓細(xì)胞中PPARγmRNA和Osteocalcin mRNA基因表達(dá)、Western-blot檢測(cè)股骨頭骨髓細(xì)胞PPARγ蛋白表達(dá)結(jié)果顯示M、CO組股骨頭內(nèi)PPARγmRNA基因、PPARγmRNA蛋白相對(duì)β-actin的吸光度比值明顯增高,Osteocalcin mRNA基因相對(duì)β-acti

8、n的吸光度比值明顯降低,與N、S組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),S組中PPARγmRNA基因、PPARγmRNA蛋白相對(duì)β-actin的吸光度比值和Osteocalcin mRNA基因相對(duì)β-actin的吸光度比值相對(duì)N組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.長(zhǎng)期大量的酒精攝入可以導(dǎo)致酒精性股骨頭缺血壞死。
　　 2.pAdeno-X-siPPARγ重組腺病毒能夠有效阻斷PPARγ m