聯(lián)合調(diào)控PPARγ及CGRP基因表達(dá)預(yù)防酒精性股骨頭壞死的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景：
　　酒精性股骨頭壞死是骨科常見(jiàn)病，發(fā)病率有逐年增加的趨勢(shì)。該病多見(jiàn)于中青年，且多為雙側(cè)發(fā)病，未經(jīng)有效治療者將發(fā)生股骨頭塌陷，關(guān)節(jié)功能損毀，致殘率極高，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。股骨頭塌陷患者最終需要進(jìn)行人工關(guān)節(jié)置換手術(shù)，手術(shù)效果對(duì)于年輕患者來(lái)說(shuō)尚不確定，早期行人工關(guān)節(jié)置換將不可避免地行翻修術(shù)，經(jīng)濟(jì)成本較大，增加患者家庭與經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，且并發(fā)癥多、遠(yuǎn)期療效不能肯定，可見(jiàn)該病不僅給病人增加極大痛苦，還引發(fā)一系列社會(huì)問(wèn)題。
　　

2、研究發(fā)現(xiàn)酒精可誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）內(nèi)過(guò)氧化物酶體增殖子活化受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ,PPARγ)基因的高表達(dá)，誘導(dǎo)股骨頭髓腔內(nèi)干細(xì)胞的成脂分化，促進(jìn)其向脂肪細(xì)胞發(fā)展，并因脂類(lèi)物質(zhì)沉積而引發(fā)股骨頭內(nèi)高壓，同時(shí)成骨分化能力減弱，最終發(fā)生股骨頭壞死。抑制或阻斷PPARγ基因的表達(dá)則抑制其成

3、脂分化，保持成骨分化的特點(diǎn)，減少股骨頭壞死的發(fā)生率。降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)為一種調(diào)節(jié)骨組織生長(zhǎng)代謝的神經(jīng)肽基因，可促進(jìn)骨髓干細(xì)胞的增殖能力和成骨活性，與骨代謝和修復(fù)密切相關(guān)。因此，通過(guò)聯(lián)合調(diào)控PPARγ基因和CGRP基因的表達(dá)，抑制骨髓干細(xì)胞的成脂分化，同時(shí)主動(dòng)增強(qiáng)其成骨分化的能力成為預(yù)防酒精性股骨頭壞死新的研究方向。
　　目的：
　　通過(guò)構(gòu)建能夠沉默PP

4、ARγ，同時(shí)表達(dá)CGRP的雙基因重組載體，觀察聯(lián)合調(diào)控PPARγ基因和CGRP基因的表達(dá)對(duì)酒精誘導(dǎo)下兔BMSCs成脂、成骨分化能力的影響；采用致敏法與酒精灌胃法制作兔酒精性O(shè)NFH模型，將雙基因重組載體轉(zhuǎn)染的BMSCs植入動(dòng)物模型股骨頭內(nèi)，觀察其對(duì)酒精性股骨頭壞死的預(yù)防效果，對(duì)預(yù)防股骨頭壞死的進(jìn)一步研究提供新的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本研究分為以下三個(gè)部分：
　　第一部分、沉默PPARγ表達(dá)CGRP基因重組載體的構(gòu)建與鑒定
　　方法：

5、r>　?。?）發(fā)卡樣siRNA（shRNA）寡核苷酸鏈的設(shè)計(jì)與合成：按照siRNA片段的設(shè)計(jì)原則，依據(jù)GenBank中PPARγ的基因序列，篩選并合成合成2條PPARγsiRNA寡核苷酸鏈，3'和5'端分別加入BamHⅠ和HindⅢ的酶切殘基，并在設(shè)計(jì)時(shí)改變BamHⅠ酶切位點(diǎn)的一個(gè)堿基。
　?。?）兔CGRP基因完整ORF克?。呵捌诘玫酵肅GRP基因完整ORF克隆，設(shè)計(jì)其兩端帶MluI酶切位點(diǎn)，與TGFP融合蛋白表達(dá)單元間用一段柔

6、性鏈連接。
　?。?）重組載體的構(gòu)建：發(fā)卡樣 siRNA寡核苷酸靶序列退火后克隆入線(xiàn)性化pGFP-V-RS載體，得到沉默PPARγ的沉默載體pGFP-V-RS-siPPARγ；CGRP基因ORF cDNA純化后與線(xiàn)性化pGFP-V-RS載體連接，得到表達(dá)CGRP的表達(dá)載體pGFP-V-RS-exCGRP；CGRP ORF cDNA片段克隆入沉默載體pGFP-V-RS-siPPARγ，得到沉默PPARγ、表達(dá)CGRP雙基因載體pGF

7、P-V-RS-siPPARγ-exCGRP。
　　結(jié)果：
　　經(jīng)酶切和DNA測(cè)序鑒定正確，三種重組載體構(gòu)建成功，為進(jìn)一步觀察雙基因重組載體對(duì)酒精誘導(dǎo)下BMSCs成脂、成骨分化的影響提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　第二部分、聯(lián)合調(diào)控PPARγ及CGRP基因表達(dá)對(duì)酒精誘導(dǎo)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化的影響
　　方法：
　?。?）密度梯度離心法獲取兔BMSCs，流式細(xì)胞儀行表面抗原CD29，CD34、CD44、CD45、CD105

8、鑒定。
　?。?）應(yīng)用BTX ECM2001電轉(zhuǎn)儀系統(tǒng)將重組載體分別電轉(zhuǎn)入BMSCs中，并在需要酒精誘導(dǎo)的各組中加入酒精，終濃度均保持在0.09mol/L，同時(shí)設(shè)立對(duì)照組。MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況。細(xì)胞培養(yǎng)7天、14天時(shí)，TaqMan RT-PCR和Western blot檢測(cè)PPARγ、CGRP、Runx2、osteocalcin mRNA及蛋白的表達(dá)。細(xì)胞培養(yǎng)14天檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量、堿性磷酸酶（ALP）活性、培養(yǎng)

9、基中骨鈣素含量、層粘連蛋白含量、I型膠原含量，并行 ALP染色。細(xì)胞培養(yǎng)21天，行油紅“O”脂肪染色。
　　結(jié)果：
　?。?）流式細(xì)胞儀檢測(cè)表面標(biāo)志物結(jié)果顯示，BMSCs表達(dá)CD29、CD44、CD105，陽(yáng)性率分別為99.86％，99.34%，99.65%；CD34、CD45呈陰性，陽(yáng)性率分別為1.27%，1.45%。得到高純度的BMSCs。
　?。?）酒精誘導(dǎo)下，轉(zhuǎn)染沉默載體pGFP-V-RS-siPPARγ的BM

10、SCs組中，細(xì)胞增殖曲線(xiàn)稍低于正常組，無(wú)顯著性變化（P>0.05）；PPARγ、Runx2和Osteocalcin mRNA及蛋白的表達(dá)與正常組中接近，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；細(xì)胞中甘油三酯含量、ALP活性、培養(yǎng)基中骨鈣素含量、層粘連蛋白含量、I型膠原含量與正常組接近，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。實(shí)驗(yàn)第14天時(shí)，ALP染色結(jié)果顯示，部分細(xì)胞胞漿染色為藍(lán)/紫色，與Normal組接近。實(shí)驗(yàn)第21天，細(xì)胞中沒(méi)有脂滴發(fā)現(xiàn)或極少發(fā)

11、現(xiàn)，油紅“O”脂肪染色結(jié)果顯示，細(xì)胞中極少有橘紅色脂滴發(fā)現(xiàn)。
　?。?）轉(zhuǎn)染表達(dá)載體pGFP-V-RS-exCGRP的BMSCs組中，細(xì)胞增殖曲線(xiàn)稍低于Normal組，無(wú)顯著性變化（P>0.05）；能穩(wěn)定表達(dá)CGRP mRNA及蛋白；PPARγmRNA及蛋白的表達(dá)、細(xì)胞中甘油三酯含量高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；Runx2和Osteocalcin mRNA及蛋白的表達(dá)、細(xì)胞中ALP活性、培養(yǎng)基中骨鈣素含量、層粘連蛋

12、白含量、I型膠原含量稍低于正常組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。實(shí)驗(yàn)第14天時(shí)，ALP染色結(jié)果顯示，部分細(xì)胞胞漿染色為藍(lán)/紫色，與Normal組接近。實(shí)驗(yàn)第21天，細(xì)胞中可以見(jiàn)到大小不一的圓形脂滴，表現(xiàn)為折光較強(qiáng)的圓形黑色顆粒環(huán)，油紅“O”脂肪染色結(jié)果顯示，細(xì)胞中可見(jiàn)大量橘紅色脂滴形成。
　　（4）轉(zhuǎn)染雙基因載體pGFP-V-RS-siPPARγ-exCGRP的BMSCs組中，細(xì)胞增殖曲線(xiàn)與正常組基本一致，無(wú)顯著性變化（P>0

13、.05）。能穩(wěn)定表達(dá)CGRP mRNA及蛋白；PPARγ mRNA、蛋白的表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的含量得到有效抑制，與正常組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；Runx2和Osteocalcin mRNA及蛋白的表達(dá)量、ALP活性、培養(yǎng)基中骨鈣素含量、層粘連蛋白含量、I型膠原含量均高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)第14天時(shí)，ALP染色結(jié)果顯示，大量細(xì)胞胞漿染色為藍(lán)/紫色，較正常組多。實(shí)驗(yàn)第21天，細(xì)胞中沒(méi)有脂滴發(fā)現(xiàn)或

14、極少發(fā)現(xiàn)，油紅“O”脂肪染色結(jié)果顯示，細(xì)胞中極少有橘紅色脂滴發(fā)現(xiàn)。
　　第三部分、聯(lián)合調(diào)控PPARγ及CGRP基因表達(dá)預(yù)防兔酒精性O(shè)NFH的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究
　　方法：
　　（1）動(dòng)物模型的制作：取健康新西蘭大耳白兔80只，隨機(jī)平均分組為5組，每組16只。按10ml/kg劑量經(jīng)兔耳緣靜脈行馬血清注射，3周后再次注射馬血清致敏，劑量同前。2周后10ml/(kg·d)的烈性白酒(體積分?jǐn)?shù)為46%的乙醇)灌胃，此時(shí)作為實(shí)驗(yàn)第0天

15、，并于實(shí)驗(yàn)的第1、3、6周的第一天，用特制骨髓穿刺針在股骨頭頸交界處向一側(cè)股骨頭內(nèi)鉆約0.5cm的針孔，微量注射器取轉(zhuǎn)染有重組載體的BMSCs25μl隨機(jī)注入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一側(cè)股骨頭內(nèi)，骨蠟堵閉穿刺孔道。分別于實(shí)驗(yàn)的第4、8周末分批處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。
　?。?）實(shí)驗(yàn)分組：1、實(shí)驗(yàn)組（S組）：馬血清致敏完成后烈性白酒10ml/(kg·d)灌胃，并向一側(cè)股骨頭內(nèi)注射轉(zhuǎn)染有雙基因載體 pGFP-V-RS-siPPARγ-exCGRP的BMSCs。

16、2、空載體組（Con組）：馬血清致敏完成后烈性白酒10ml/(kg·d)灌胃，并向一側(cè)股骨頭內(nèi)注射轉(zhuǎn)染有空載體pGFP-V-RS的BMSCs。3、模型組（M組）：馬血清致敏完成后烈性白酒10ml/(kg·d)灌胃。4、致敏組（H組）：僅行馬血清致敏。（5）空白對(duì)照組（N組）：空白對(duì)照。
　?。?）組織形態(tài)學(xué)的觀察：取出股骨頭并沿冠狀面將其剖開(kāi)，行蘇丹Ⅲ脂肪染色及 HE染色，分別對(duì)以下指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)：1、骨壞死發(fā)生率2、骨小梁面積分?jǐn)?shù)

17、3、空骨陷窩計(jì)數(shù)4、最大脂肪細(xì)胞平均直徑。
　?。?）成脂及成骨分化相關(guān)基因的檢測(cè)：TaqMan Real Time-PCR檢測(cè)PPARγ、CGRP、Runx2、osteocalcin mRNA；Western blot檢測(cè)PPARγ、CGRP、Runx2、osteocalcin蛋白。
　　結(jié)果：
　?。?）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物股骨頭組織形態(tài)學(xué)變化：酒精灌胃8w時(shí)，M組和Con組的骨小梁變細(xì)，稀疏、中斷、排列紊亂，骨小梁面積明顯減

18、少；股骨頭軟骨下區(qū)骨髓內(nèi)的脂肪組織明顯增多，脂肪細(xì)胞增大，有的融合成泡，造血組織明顯減少，桔紅色的脂質(zhì)充滿(mǎn)軟骨下區(qū)的骨細(xì)胞及骨髓腔內(nèi)。這些病理變化在N組、H組和S組中并未發(fā)現(xiàn)。
　　（2）實(shí)驗(yàn)第4周時(shí)M組和Con組的空骨陷窩計(jì)數(shù)較N組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；H組和S組中的空骨陷窩計(jì)數(shù)與N組中接近，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。實(shí)驗(yàn)第8周時(shí)，M組和Con組中最大脂肪細(xì)胞平均直徑、空骨陷窩計(jì)數(shù)較N組明顯增加，骨小梁

19、面積分?jǐn)?shù)較N組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；S組及H組中最大脂肪細(xì)胞平均直徑、空骨陷窩計(jì)數(shù)以及骨小梁面積分?jǐn)?shù)與N組相比無(wú)明顯差異（P>0.05）。
　?。?）PPARγ、CGRP、 Runx2、Osteocalcin mRNA和蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果：實(shí)驗(yàn)第4、8周，M組與Con組股骨頭骨髓細(xì)胞內(nèi)PPARγmRNA和蛋白呈高表達(dá)，與N組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），CGRP、Runx2及osteocalcin mRNA

20、和蛋白呈低表達(dá)，與N組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。S組中PPARγ mRNA和蛋白表達(dá)量與N組接近，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），CGRP、Runx2及osteocalcin mRNA和蛋白呈高表達(dá)，與N組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；H組中PPARγ、CGRP、Runx2及osteocalcin mRNA和蛋白表達(dá)量與N組接近，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　?。?）成功構(gòu)建三種調(diào)控

21、PPARγ和CGRP基因的重組載體：能夠沉默PPARγ基因的沉默載體pGFP-V-RS-siPPARγ；能夠表達(dá)CGRP基因的表達(dá)載體pGFP-V-RS-exCGRP；能夠沉默 PPARγ，同時(shí)表達(dá)CGRP的雙基因載體pGFP-V-RS-siPPARγ-exCGRP，經(jīng)酶切鑒定和DNA測(cè)序完全正確。
　?。?）沉默PPARγ表達(dá)CGRP的雙基因重組載體能有效阻斷酒精誘導(dǎo)的BMSCs內(nèi)PPARγ mRNA和蛋白的表達(dá)，抑制細(xì)胞的成脂

22、分化，同時(shí)增加了BMSCs的成骨相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)了其成骨分化的能力。
　?。?）通過(guò)聯(lián)合調(diào)控PPARγ及CGRP基因的表達(dá)，可顯著減少酒精誘導(dǎo)的兔股骨頭內(nèi)脂肪物質(zhì)的堆積，同時(shí)增強(qiáng)了股骨頭內(nèi)BMSCs的成骨分化能力，促進(jìn)骨組織的修復(fù)和重建，有效預(yù)防了酒精性股骨頭壞死的發(fā)生。
　?。?）本實(shí)驗(yàn)利用靶向PPARγsiRNA和CGRP基因共同構(gòu)建雙基因重組載體，并轉(zhuǎn)染入BMSCs，通過(guò)阻斷PPARγ基因，高效阻止細(xì)胞成脂分