不同濃度葡萄糖與葡萄糖波動(dòng)對(duì)大鼠腎系膜細(xì)胞損傷及RAGE表達(dá)的影響.pdf_第1頁(yè)
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1、研究背景及目的:糖尿病腎?。―iabetic nephropathy,DN)是糖尿病主要的微血管并發(fā)癥之一,是導(dǎo)致糖尿病患者死亡的重要原因,其發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明,其中高血糖的毒性作用是最重要的因素之一。以往無(wú)論是臨床還是基礎(chǔ)研究都比較重視持續(xù)性高血糖。隨著研究的不斷深入,人們開(kāi)始逐漸關(guān)注起了血糖波動(dòng)引起的危害。近年研究表明,糖尿病的預(yù)后及慢性并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展不僅與整體血糖水平的持續(xù)升高密切相關(guān),而且與血糖波動(dòng)性也有密切關(guān)系。本實(shí)

2、驗(yàn)旨在通過(guò)體外實(shí)驗(yàn),用不同濃度的持續(xù)性葡萄糖和波動(dòng)的葡萄糖同時(shí)作用于大鼠腎小球系膜細(xì)胞,并通過(guò)細(xì)胞形態(tài)觀察.氧化應(yīng)激和糖基化終未產(chǎn)物(Advanced glycation end products.AGEs)途徑相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè).觀察不同濃度葡萄糖對(duì)系膜細(xì)胞的作用,及葡萄糖濃度波動(dòng)和持續(xù)穩(wěn)定高糖對(duì)系膜細(xì)胞產(chǎn)生作用的差異,探索波動(dòng)性高血糖促進(jìn)DN的病理?yè)p傷機(jī)制,從而對(duì)臨床控制血糖的措施和防止DN的發(fā)生提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法:所有

3、實(shí)驗(yàn)均在體外培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞(GMC)上進(jìn)行。根據(jù)不同濃度葡萄糖和葡萄糖濃度波動(dòng)及相關(guān)對(duì)照組分別處理細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞分為6組,分別為正常對(duì)照組(N)、持續(xù)高糖組(H1和H2)、血糖濃度波動(dòng)組(F)、總負(fù)載相同對(duì)照組(L)、滲透壓對(duì)照組(P),其中血糖濃度波動(dòng)組(F)的細(xì)胞通過(guò)有規(guī)律地改變培養(yǎng)液中葡萄糖的濃度高低來(lái)建立血糖波動(dòng)的環(huán)境。各組細(xì)胞分別培養(yǎng)24h、48h、72h后,進(jìn)行細(xì)胞學(xué)形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察,MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率,生化法

4、測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的含量,RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)mRNA的表達(dá)情況。 結(jié)果: 1.細(xì)胞形態(tài)學(xué)與生存率:N組細(xì)胞呈單層鋪路石狀緊密排列。培養(yǎng)24h時(shí),F(xiàn)組細(xì)胞呈現(xiàn)扁平狀,表現(xiàn)出抑制細(xì)胞增殖的作用,其余各組細(xì)胞變化不明顯;48h時(shí),除N組外其余各組細(xì)胞形態(tài)均出現(xiàn)明顯改變,L、H1組在48h內(nèi)促進(jìn)細(xì)胞增殖,與N組有明顯的差異(P<0.05),其他各組多

5、數(shù)細(xì)胞由原來(lái)的飽滿梭形變?yōu)楠M長(zhǎng)形或不規(guī)則形,與N組相比表現(xiàn)出不同程度的抑制系膜細(xì)胞增殖的作用(P<0.05),以F組最為顯著(P<0.01);48h后高糖組(L、H1、H2)出現(xiàn)以劑量依賴形式抑制細(xì)胞增殖的作用。 2.SOD活性(U/ml)測(cè)定:24h時(shí)F組與L、H2組SOD活性指標(biāo)分別是12.97±1.86、14.37±0.81、12.99±1.34,各組之間比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但F、H2組與N組(15.80±

6、0.88)、P組(15.47±0.72)比較,SOD活性明顯降低(P<0.05);48h時(shí),除P組外,其余各組SOD活性,與N組比較均降低,F(xiàn)組與H2、L、P組比較,也具有顯著差異和極顯著性差異(P<0.05和P<0.01)。P組與N組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 3.MDA含量(μM)的測(cè)定:除P組外,其余各組細(xì)胞在24h及48h時(shí)均能使細(xì)胞上清液中MDA含量增加,顯著高于N組(P<0.01),且F組與高糖各組比較也具有

7、顯著性差異(P<0.05)。P組與N組無(wú)顯著性差異(P>0.05)。 4.所有標(biāo)本中均能檢測(cè)到RAGE mRNA的表達(dá),24h時(shí)高糖各組和F組細(xì)胞表面RAGE表達(dá)含量已開(kāi)始上調(diào),都顯著高于N組(P<0.01),高糖各組和F組相比,出現(xiàn)不同程度差異(P<0.05,P<0.01)。48h時(shí),F(xiàn)組與高糖組相比差異更加顯著(P<0.01)。P組細(xì)胞中RAGE mRNA的表達(dá)與N組表達(dá)無(wú)明顯差異。高糖組RAGE表達(dá)含量呈濃度時(shí)間依賴性。

8、 結(jié)論: 1.高糖在一定濃度和一定時(shí)段內(nèi)有刺激大鼠系膜細(xì)胞增殖的效應(yīng),隨著時(shí)間的延長(zhǎng)此效應(yīng)消失,并出現(xiàn)抑制細(xì)胞增殖的作用。波動(dòng)性高血糖抑制大鼠系膜細(xì)胞增殖,且抗增殖作用大于持續(xù)性高葡萄糖濃度組。 2.細(xì)胞外高糖環(huán)境能損傷腎系膜細(xì)胞,表現(xiàn)在細(xì)胞生存率降低、MDA生成增加、SOD活性降低,呈一定濃度時(shí)間依賴性的氧化應(yīng)激損傷。 3.持續(xù)高糖環(huán)境對(duì)細(xì)胞造成了一定的損傷,但是葡萄糖濃度波動(dòng)后這種損傷總體上明顯加劇。它

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