不同濃度葡萄糖對體外培養(yǎng)小鼠成纖維細(xì)胞功能的影響.pdf

1、研究背景： 在外科危重病人中常常遇到高血糖，很大的因素是應(yīng)激性高血糖以及許多糖尿病病人，血糖持續(xù)升高可對機體產(chǎn)生一系列的不良反應(yīng)，增加機體高滲性昏迷、糖尿病酮癥酸中毒發(fā)生的可能性，嚴(yán)重危及生命。高血糖的發(fā)生提示機體處于代謝紊亂狀態(tài)，其持續(xù)存在更增加了感染的風(fēng)險。因此如何應(yīng)對創(chuàng)傷伴隨高血糖并發(fā)癥的出現(xiàn)，一直是創(chuàng)傷外科亟待解決的問題。創(chuàng)面損傷修復(fù)時，創(chuàng)傷組織的高糖環(huán)境對成纖維細(xì)胞的生長有著很大影響，使得創(chuàng)面愈合這一過程變得更為復(fù)雜。

2、 創(chuàng)傷愈合是一個復(fù)雜而有序的生物學(xué)過程，涉及炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖、遷移，創(chuàng)面重塑等多個序貫又相互交叉的病理生理過程。研究已發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞（fibroblast）在此修復(fù)過程中起著十分重要的作用。長期以來它也一直被視為是肉芽組織收縮的能量供應(yīng)者，對傷口有效而迅速的關(guān)閉起著重要的作用。爾后提出了肌成纖維細(xì)胞細(xì)胞的概念，肌成纖維細(xì)胞被認(rèn)為是由創(chuàng)口周圍的皮膚、皮下組織中的成纖維細(xì)胞在各種刺激因子的作用下轉(zhuǎn)變而來，其分泌的肌動蛋白（α—sm

3、ooth muscle actin，α—SMA）被普遍認(rèn)為是肌成纖維細(xì)胞表型的可靠證據(jù)。 創(chuàng)傷后引起的高血糖對于創(chuàng)面愈合有著十分重要的影響，普遍認(rèn)為高血糖會影響創(chuàng)面的愈合，然而卻沒有關(guān)于高糖環(huán)境對于成纖維細(xì)胞生物功能影響的細(xì)胞分子生物學(xué)研究以及成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞細(xì)胞在高糖環(huán)境下的關(guān)系的研究。 本實驗即是利用體外培養(yǎng)小鼠成纖維細(xì)胞，在體外模擬高血糖的環(huán)境，設(shè)定不同糖濃度，探討不同時間下成纖維細(xì)胞生長增殖情況和膠原合成

4、情況以及其和肌成纖維細(xì)胞細(xì)胞之間的關(guān)系，進行基礎(chǔ)性研究。 實驗?zāi)康模?1．體外培養(yǎng)和鑒定小鼠皮膚成纖維細(xì)胞。 2．研究不同糖濃度和時間下成纖維細(xì)胞生長增殖情況和膠原合成情況。 3．研究不同糖濃度培養(yǎng)液條件下成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的情況 實驗方法： 將昆明小鼠斷頸處死后，在其背部用備皮刀將毛刮凈后酒精消毒，取1cm×1cm大小的皮膚，用消毒剪剪下皮膚后，用生理鹽水洗凈，剪碎后用1％膠原

5、酶溶液37℃水浴下作用10分鐘，然后用100目的金屬網(wǎng)篩過濾，取過濾液用試管1000轉(zhuǎn)/分下離心，棄上清，用10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液（糖濃度為25mmol/L）將沉淀溶解，并放入培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，成纖維細(xì)胞約3小時后即可貼壁生長，待細(xì)胞貼壁后即刻棄上清，用10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長后傳代數(shù)次，純化后得到小鼠皮膚成纖維細(xì)胞。在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入一定量的左旋葡萄糖，配成配置成糖濃度梯度為25，40，55，

6、70，85 mmol/L的培養(yǎng)液，其滲透壓計算后分別為（5311 mmHg，5603 mmHg，5896 mmHg，6181 mmHg，6474 mmHg），在正常值511～6227 mmHg范圍內(nèi)或稍高。依次為A，B，C，D，E五個糖濃度組，分別進行成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)，利用爬片法進行細(xì)胞免疫組織化學(xué)法鑒定成纖維細(xì)胞；然后使用CCK—8方法測定不同糖濃度培養(yǎng)液培養(yǎng)12h、24h和48h成纖維細(xì)胞增殖情況，用Elisa方法測定不同糖濃度培養(yǎng)

7、液培養(yǎng)12h、24h和48h成纖維細(xì)胞分泌I型膠原的情況；最后用Western—blot方法測定不同濃度培養(yǎng)液培養(yǎng)12h、24h和48h后成纖維細(xì)胞肌動蛋白（α—SMA）的含量。 結(jié)果： 1．成纖維細(xì)胞免疫組織化學(xué)法鑒定含有Ⅰ型膠原的成纖維細(xì)胞被染成棕色，細(xì)胞成多邊形和長梭形，細(xì)胞較大，且鏡下幾乎均為染色的細(xì)胞；證實原代培養(yǎng)的細(xì)胞中成纖維細(xì)胞為主，且純度較高，細(xì)胞間未觀察到有被染色的Ⅰ型膠原 2．利用CCK試劑盒

8、測定成纖維細(xì)胞的增殖，OD值和細(xì)胞數(shù)目成正比。結(jié)果如表1所示：（1）在相同培養(yǎng)時間條件下，隨著糖濃度的增加（大于40mmol/L），成纖維細(xì)胞數(shù)目進行性減少（P<0．01）：（2）在24，40mmol/L培養(yǎng)濃度下，隨著培養(yǎng)時間的增加，成纖維細(xì)胞的數(shù)目逐漸增加；（3）在55，70，85 mmol/L培養(yǎng)濃度下，成纖維細(xì)胞的數(shù)目無明顯變化。 3．利用Elisa試劑盒測定細(xì)胞外Ⅰ型膠原，結(jié)果顯示每組均可檢測到細(xì)胞外Ⅰ型膠原的存在，統(tǒng)

9、計結(jié)果顯示其每組的成纖維細(xì)胞產(chǎn)生Ⅰ型膠原在相同時間不同培養(yǎng)濃度下的總量并無明顯差別（P>0．05）。 4．對細(xì)胞進行既定處理后，對成纖維細(xì)胞肌動蛋白的表達(dá)做了半定量測定，隨著濃度的增加，成纖維細(xì)胞中表達(dá)肌動蛋白的量是上升的。 結(jié)論： 1．利用膠原酶消化法原代分離和培養(yǎng)皮膚成纖維細(xì)胞的方法是可行的，并且可以得到純度較高的成纖維細(xì)胞。細(xì)胞免疫組織化學(xué)法鑒定成纖維細(xì)胞時未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞間Ⅰ型膠原纖維，Ⅰ型膠原纖維可以通過組織

10、液吹打的方法收集。 2．隨著細(xì)胞培養(yǎng)液糖濃度的升高，在糖濃度40mmol/L的范圍內(nèi)，隨著糖濃度升高，成纖維細(xì)胞的增殖不受影響，隨著糖濃度的進一步升高，成纖維細(xì)胞的增殖速度明顯下降，高糖濃度可以抑制成纖維細(xì)胞的增殖（P<0．01）。 3．隨著糖濃度的升高，成纖維細(xì)胞分泌Ⅰ型膠原纖維的量并無太大變化（P>0．05），但是在相同培養(yǎng)時間條件下，隨著糖濃度的增加（大于40mmol/L），成纖維細(xì)胞數(shù)目進行性減少（P<0．01）