抗人MMP-11多克隆抗體制備及檢測月經(jīng)血初探.pdf

1、將已構建好的重組的原核表達載體pGEX-5X-3/MMP-11轉化到大腸桿菌DH5α中進行誘導表達，將表達的基質金屬蛋白酶-11(matrixmetalloproteinase11，MMP-11)蛋白純化后免疫雌性新西蘭兔，制備抗MMP-11蛋白的多克隆抗體。通過免疫印跡(Westernblot)技術驗證抗MMP-11蛋白多克隆抗體的特異性，用ELISA方法測定抗MMP-11蛋白多克隆抗體的效價。進而通過免疫組織化學染色方法探討該抗體區(qū)

2、分月經(jīng)血與外周血的可行性。以期為建立用MMP-11抗體快速、準確檢測月經(jīng)血的免疫學方法提供建設性意見。解決法醫(yī)學實踐中月經(jīng)血鑒定困難的現(xiàn)實問題，對于保護婦女權益及維護社會穩(wěn)定等都具有極其重要的社會現(xiàn)實意義。 一、MMP-11蛋白的表達本試驗首先制備感受態(tài)大腸桿菌DH5α，將pGEX-5X-3/MMP-11轉入感受態(tài)DH5α中，用含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液培養(yǎng)，挑選陽性克隆，用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切法鑒定，獲得的質粒DNA含MM

3、P-11基因片段。接著通過對不同異丙基-β-D硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG)濃度(0.3mmol/L、0.6mmol/L、1.0mmol/L)、不同誘導時間(1h、2h、3h、4h、7h)和不同誘導溫度(30℃、37℃)下蛋白量表達的研究，選擇實驗的最佳誘導條件為30℃誘導4h，IPTG濃度為1.0mmol/L。最后將誘導表達的融合蛋白與標準抗MMP-11單克隆抗體進行Western

4、blot分析，結果表明融合蛋白具有MMP-11抗原的特異性，分子量為45.5KD，符合預期結果。 二、抗MMP-11抗體制備將含有目的融合蛋白的菌液經(jīng)SDS-PAGE電泳，割取目的條帶，分別使用研磨后加佐劑免疫兔和直接免疫兔兩種方法，免疫5次后采集抗血清，經(jīng)飽和硫酸銨沉淀法純化抗體，用ELISA間接法測定抗血清效價達1∶12800。免疫印跡技術檢測結果表明兩種免疫方法都可以獲得特異性抗MMP-11抗體。 三、月經(jīng)血檢測初

5、探取2名健康志愿者月經(jīng)周期第一、第二天月經(jīng)血及其靜脈血涂片，用自制抗血清作為第一抗體，生物素標記羊抗兔IgG為第二抗體，經(jīng)免疫組化染色表明，MMP-11蛋白存在于間質細胞及子宮內(nèi)膜上皮細胞內(nèi)；靜脈血涂片未見有MMP-11染色。1例子宮內(nèi)膜組織切片檢測結果可知，除了間質細胞中可見MMP-11顆粒外，腺上皮細胞內(nèi)也富集了大量MMP-11蛋白顆粒。說明自制抗體能有效的檢測MMP-11，從而區(qū)分月經(jīng)血和靜脈血。 結論：從已構建的重組原核