人胱抑素C可溶性表達、多克隆抗體制備及檢測方法的建立.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、胱抑素C(Cystatin C,CysC)即半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白C,是一種非糖基化的堿性低分子量蛋白質(zhì)。該蛋白能夠在所有有核細胞中穩(wěn)定表達,幾乎不受年齡、性別、體重、感染、飲食、體表面積等因素的影響。胱抑素C是迄今為止基本能夠滿足腎小球濾過率(GFR)理想內(nèi)源性標志物要求的物質(zhì),對于早期腎功能損傷的診斷和治療具有重要意義。其檢測方法主要是免疫學法,但目前國內(nèi)CysC診斷試劑及標準品主要由國外公司提供,價格昂貴,使病人和社會醫(yī)療成本較高

2、。因此,胱抑素C免疫診斷試劑盒的自主研發(fā)具有重要的價值和意義。
  目的:
  獲得Trx-CysC以及無蛋白標簽的CysC兩種可溶性重組蛋白。用純化的無蛋白標簽CysC重組蛋白制備蛋白標準品。用Trx-CysC作為免疫原免疫新西蘭大白兔獲得CysC的多克隆抗體,建立CysC顆粒增強透射免疫比濁法(particle enhanced turbidimetric immunoassay,PETIA)并進行初步方法學評價,為該方

3、法的臨床應用奠定基礎。
  方法:
  1.在不改變氨基酸序列的前提下,對CysC的全長編碼基因進行大腸桿菌同義密碼子偏好性優(yōu)化后人工合成其序列,并插入原核表達載體pET32a(+),楗CysC優(yōu)化后的原核表達質(zhì)粒pET32a(+)-CysC。經(jīng)測序鑒定正確后,將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中,經(jīng)IPTG誘導重組蛋白可溶性表達并純化獲得Trx-CysC。
  2.從HL60細胞株提取總RNA,行RT-PC

4、R獲得cDNA模板,再經(jīng)高保真PCR獲得CysC的DNA片段。將該人CysC的全長編碼基因插入原核表達載體pCold TF,構(gòu)建CysC原核表達質(zhì)粒pCold TF-CysC。待測序結(jié)果與預期相符后,將該重組質(zhì)粒pCold TF-CysC轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中,經(jīng)IPTG誘導重組蛋白表達并純化獲得可溶性重組蛋白TF-CysC。利用GST-HRV3C蛋白酶切除該融合蛋白的TF標簽,再經(jīng)分子篩去除TF標簽、3C蛋白酶獲得無蛋白標

5、簽的CysC,SDS-PAGE鑒定其純度。
  3.用純化的重組蛋白Trx-CysC作為免疫原免疫新西蘭大白兔,經(jīng)蛋白A柱純化制備CysC多克隆抗體。
  4.采用已純化的CysC多克隆抗體包被膠乳顆粒,建立檢測CysC的PETIA方法,并進行初步方法學評價。
  結(jié)果:
  1.經(jīng)分子克隆和蛋白表達技術(shù),獲得了可溶性表達的Trx-CysC。由于該重組蛋白帶有6×His標簽,所以可通過鎳柱親和純化獲得高純度的重組

6、蛋白制品。以該蛋白免疫新西蘭大白兔,獲得CysC的多克隆抗體。
  2.經(jīng)分子克隆和蛋白表達技術(shù),獲得了可溶性表達的TF-CysC,并通過鎳柱和分子篩兩步純化法成功獲得無蛋白標簽、可作為蛋白標準品的CysC。
  3.用自制的CysC多克隆抗體包被膠乳顆粒,建立檢測CysC的PETIA方法,該方法與進口商品化試劑盒具有良好的相關性,具有一定的應用潛力和市場前景。
  結(jié)論:
  1.利用分子克隆和重組蛋白技術(shù)獲得

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