MMP-11多克隆抗體檢測(cè)月經(jīng)血的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究.pdf

1、將制備的兔抗人MMP-11(Matrix Metalloproteinase-11，MMP-11)多克隆抗體進(jìn)行純化，驗(yàn)證抗MMP-11多克隆抗體純化前后的效果。運(yùn)用免疫印跡(Western blot)法檢測(cè)月經(jīng)血痕、外周血痕、陰道液斑、精液斑、唾液斑、尿液斑的MMP-11蛋白，并進(jìn)行月經(jīng)血痕的MMP-11靈敏度分析，盲測(cè)驗(yàn)證該方法的可靠性；通過(guò)免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)MMP-11蛋白，區(qū)分月經(jīng)血與陰道液。以期建立用MMP-11抗體快速

2、、準(zhǔn)確檢測(cè)月經(jīng)血的免疫學(xué)方法，解決常規(guī)月經(jīng)血檢測(cè)方法的局限性，以及RT-PCR技術(shù)操作繁瑣耗時(shí)，不利于實(shí)踐中快速檢測(cè)的缺陷，為解決檢測(cè)月經(jīng)血的難題建立一種實(shí)用的方法。 一、抗人MMP-11多克隆抗體的純化與鑒定 本課題組前期已成功制備了兔抗人MMP-11多克隆抗體，本試驗(yàn)采用飽和硫酸銨鹽析沉淀法對(duì)其進(jìn)行純化。運(yùn)用免疫印跡法和Bradford蛋白定量法對(duì)純化前后的兔抗血清進(jìn)行鑒定，結(jié)果在相對(duì)分子量(Mr)為45.5×10<

3、'3>道爾頓處，檢見(jiàn)目的條帶，抗MMP-11抗體經(jīng)純化后純度明顯提高。 二、免疫印跡法檢測(cè) 斑痕MMP-11收集各種斑痕標(biāo)本，包括月經(jīng)血痕(n=30)、陰道液斑(n=36)、外周血痕(n=30)、精液斑(n=17)、唾液斑(n=25)、尿液斑(n=20)，提取總蛋白并進(jìn)行Bradford蛋白定量，采用Western blot方法以1:1000稀釋的純化抗血清作為一抗檢測(cè)MMP-11；收集2例MMP-11檢測(cè)陽(yáng)性的月經(jīng)血，

4、制成定量血痕，進(jìn)行靈敏度檢測(cè)；分別研究MMP-11檢測(cè)陽(yáng)性月經(jīng)血痕于4℃、室溫(20℃-33℃)下放置天數(shù)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響；將外周血和MMP-11陽(yáng)性的月經(jīng)血痕共6例，單盲法進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果：①月經(jīng)血痕MMP-11蛋白的檢測(cè)陽(yáng)性率為90.48﹪(93/105)，前4天的月經(jīng)血痕檢測(cè)率差異無(wú)顯著性意義；②外周血痕、精液斑、唾液斑、尿液斑、陰道液斑均未檢出MMP-11，顯示出明顯的器官特異性；③靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示月經(jīng)血蛋白含量≥39.76μg

5、(血液量1～1.5μl)時(shí)便可有效測(cè)出其中所含MMP-11抗原；④干燥環(huán)境下月經(jīng)血痕中MMP-11抗原的抵抗力較強(qiáng)， 4℃保存一年檢出陽(yáng)性率為91.67﹪(11/12)，20～33℃保存的MMP-11陽(yáng)性血痕能正確檢測(cè)的最長(zhǎng)時(shí)限為20周；⑤4例盲測(cè)樣本結(jié)果與已知比對(duì)，結(jié)果正確。提示所建立的方法用來(lái)檢測(cè)斑痕：MMP-11較特異可靠，可用于檢測(cè)陳舊月經(jīng)血痕MMP-11抗原。 三、免疫組織化學(xué)染色檢測(cè) MMP-11將健康志愿者

6、的新鮮月經(jīng)血及陰道液分別涂片，同時(shí)將室溫放置1月的陳舊月經(jīng)血痕進(jìn)行沉渣涂片，采用鏈霉卵白素.堿性磷酸酶(SAP)免疫組化法檢測(cè)MMP-11，以自制純化抗血清作為第一抗體，生物素標(biāo)記羊抗兔IgG為第二抗體。結(jié)果新鮮月經(jīng)血涂片可見(jiàn)分散、著染為紫黑色的子宮內(nèi)膜細(xì)胞，陰道液涂片未見(jiàn)陽(yáng)性染色，陳舊月經(jīng)血痕沉渣涂片染色后罕見(jiàn)完整細(xì)胞，特異信號(hào)微弱，無(wú)法判斷結(jié)果。表明免疫組化方法能檢測(cè)月經(jīng)血的MMP-11蛋白，但不適宜檢測(cè)月經(jīng)血痕中的MMP-11，同