染料木黃酮對電離輻射所致HUVEC損傷的防護(hù)作用及其機理的研究.pdf

1、近年來，隨著核能、核技術(shù)的廣泛使用，人們與放射線接觸的機會日益增多，因輻射造成的損傷日益受到關(guān)注。輻射損傷的機制之一，是受到電離輻射后機體產(chǎn)生過量的自由基，導(dǎo)致機體內(nèi)自由基的清除和產(chǎn)生失衡，誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，引起細(xì)胞膜、DNA、蛋白質(zhì)等生物大分子損傷，使機體的細(xì)胞、組織、器官的形態(tài)和功能發(fā)生改變，造成機體損傷，甚至癌變。
　　 染料木黃酮為黃酮類化合物，廣泛存在于蔬菜、水果及茶葉中，具有多種生物學(xué)活性，其抗氧化作用已得到確證。研

2、究表明染料木黃酮也具有抗輻射作用，其抗輻射功能與其具有酚羥基結(jié)構(gòu)有關(guān)。染料木黃酮抗輻射主要通過淬滅自由基，抑制脂質(zhì)過氧化，提高抗氧化酶系統(tǒng)的活性等，從而保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。
　　 血管內(nèi)皮細(xì)胞對電離輻射較為敏感，是輻射后正常組織發(fā)生放射性損傷的重要靶點之一，血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂在高血壓、心力衰竭、動脈粥樣硬化(AS)等心血管疾病的發(fā)病過程中具有重要意義?；谌玖夏军S酮在抗氧化方面的研究進(jìn)展，本實驗選用HUVEC細(xì)胞為心血管系統(tǒng)

3、輻射損傷的模型細(xì)胞，從輻射誘導(dǎo)的自由基損傷機制入手，研究X射線單次照射所致的輻射損傷效應(yīng)，探討黃酮類化合物染料木黃酮對單次X射線輻射所致?lián)p傷的防護(hù)效果及可能的作用機制，以期為染料木黃酮在心血管系統(tǒng)輻射損傷方面的研究提供實驗依據(jù)。具體內(nèi)容如下:
　　 （一）X射線致HUVEC細(xì)胞損傷模型的建立
　　 低劑量電離輻射易產(chǎn)生興奮性效應(yīng)，對免疫系統(tǒng)具有一定的刺激性作用，能提高機體免疫能力，并能使小劑量預(yù)輻射照射后的大劑量輻射產(chǎn)生

4、適應(yīng)性。較大劑量則易使細(xì)胞大量致死，降低免疫力和誘發(fā)腫瘤。因此，本部分實驗以人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)為實驗對象，建立輻射損傷的細(xì)胞模型，觀察不同時間點、不同劑量X線輻照后HUVEC細(xì)胞的存活率，以期選出合適的實驗輻照劑量。
　　 X射線分別以中低劑量75 mGy、100 mGy、200 mGy、400mGy、中高劑量1.2Gy、2.4Gy、3.6Gy、4.8Gy、6.0Gy輻照HUVEC細(xì)胞，照后分別孵育24h、48h

5、、72h，MTT法檢測各組細(xì)胞的存活率。從實驗結(jié)果來看，與正常對照組比較，中低劑量組單次照射后24h細(xì)胞活力均增強，細(xì)胞存活率均＞100％;照后48h，400、1200mGy組細(xì)胞活力降低(＜100％，p＜0.05);照后72h，各中低劑量組細(xì)胞存活率均＜100％，且隨輻照劑量的增加，細(xì)胞活力逐漸減少。中高劑量組單次輻照后24h細(xì)胞存活率均＜100％，其中3.6Gy組的損傷程度有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05);照后48h、72h各劑量組的細(xì)

6、胞活力隨著輻照劑量的增加而降低，且各劑量組的損傷程度均有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)，其中3.6Gy、4.8Gy、6.0Gy組有顯著差異(p＜0.01)。實驗結(jié)果表明中高劑量X射線對HUVEC細(xì)胞有損傷，且損傷程度與輻照劑量、損傷時間存在一定的量效關(guān)系。
　　 （二）染料木黃酮對大劑量X線輻射所致HUVEC損傷的防護(hù)作用
　　 染料木黃酮以0、5、20、50μmol/L分別于輻照前2h預(yù)作用于HUVEC細(xì)胞，3.6 Gy、

7、6.0 Gy X射線輻射后24、48 h檢測細(xì)胞內(nèi)SOD、ROS及GSH-Px的水平變化。實驗結(jié)果顯示與正常對照組比較，單純輻照組HUVEC細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH-Px的含量顯著降低(P＜0.01)，ROS含量顯著增加(P＜0.01)，且隨著輻照劑量的增加變化越明顯;與單純輻照組相比，染料木黃酮干預(yù)組能明顯改善輻射誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激引起的損傷，顯著降低ROS含量，提高SOD活性(P＜0.01)。在一定濃度范圍內(nèi)，防護(hù)作用隨著染料木黃酮濃度的增

8、加而增強，且染料木黃酮對3.6 Gy輻照劑量下的防護(hù)效果要優(yōu)于6.0 Gy輻照劑量。與單純輻照組相比，染料木黃酮各濃度組細(xì)胞內(nèi)GSH-Px水平無顯著變化(P＞0.05)。實驗結(jié)果表明染料木黃酮有一定的抗輻射作用，在一定濃度范圍內(nèi)其防護(hù)效果呈現(xiàn)濃度依賴性。
　　 （三）染料木黃酮對大劑量X線所致HUVEC細(xì)胞損傷防護(hù)機制的研究
　　 細(xì)胞自身的損傷反應(yīng)機制涉及周期阻滯、凋亡或DNA修復(fù)等信號的傳導(dǎo)有賴于磷脂酰肌醇-3-激酶

9、(PI3K)相關(guān)的蛋白激酶家族的調(diào)節(jié)，該類蛋白激酶對細(xì)胞周期、DNA修復(fù)以及細(xì)胞凋亡起著調(diào)控作用;AKT是PI3K直接作用的下游靶點，PI3K/AKT形成的通路是細(xì)胞內(nèi)重要的存活信號通路，它可以通過直接或間接介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及腫瘤血管的生成。本部分實驗將在基因和蛋白水平上檢測受輻照HUVEC細(xì)胞周期的變化及PI3K/AKT信號通路在該過程中可能的作用機制。
　　 染料木黃酮以0、5、2

10、0、50μmol/L分別于輻照前2h預(yù)作用于HUVEC，以3.6 Gy、6.0 Gy X射線照射后于24、48 h收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期;收集3.6Gy、48h的細(xì)胞進(jìn)行PCR及Western Blot，檢測PI3K、AKT、CyclinB1 mRNA和蛋白的表達(dá)。實驗結(jié)果顯示，與正常對照組細(xì)胞周期比較，HUVEC細(xì)胞經(jīng)3.6Gy、6.0GyX線輻照后24h、48h，均出現(xiàn)明顯的G2/M期阻滯，給予染料木黃酮防護(hù)后，24h、4

11、8h細(xì)胞G2期阻滯都有所緩解，表現(xiàn)為G2期細(xì)胞數(shù)量減少，S、G1期細(xì)胞數(shù)量有所增加，不同的是照后24h染料木黃酮濃度在20μmol/L時對緩解G2/M期阻滯作用最好，而照后48h最佳防護(hù)濃度則是5μmol/L。
　　 PCR結(jié)果顯示，與正常對照組細(xì)胞比較，HUVEC細(xì)胞經(jīng)3.6Gy X線照射后48h PI3KmRNA的表達(dá)略有增加，AKTmRNA的表達(dá)顯著增加(p＜0.01)，細(xì)胞周期蛋白B(CyclinB1)mRNA的表達(dá)略增

12、加;給予染料木黃酮防護(hù)后，PI3K mRNA較模型組(M)均有所增加，但無差異(p＞0.05)，AKT mRNA較模型組(M)均降低，濃度組間有差異(p＜0.05)，CyclinB1mRNA較模型組(M)均增加，但無差異(p＞0.05)。
　　 Western Blot結(jié)果顯示，與正常對照組細(xì)胞比較，HUVEC細(xì)胞經(jīng)3.6Gy X線照射后48h PI3K蛋白表達(dá)減少，AKT蛋白表達(dá)降低，活化AKT(p-AKT)蛋白表達(dá)含量則顯著

13、增加(p＜0.01)，cyclinB1蛋白表達(dá)則異常升高;給予染料木黃酮防護(hù)后，PI3K蛋白表達(dá)較模型組(M)增加，但濃度組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(p＞0.05); AKT蛋白表達(dá)較模型組(M)下降(p＜0.05)，p-AKT的表達(dá)含量較模型組(M)升高(p＜0.05); cyclinB1表達(dá)增加。實驗結(jié)果表明染料木黃酮能有效地抑制3.6Gy、6.0GyX線輻照HUVEC細(xì)胞引起的輻照損傷，對電離輻射致G2/M期阻滯有一定的緩解作用，可能與A