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1、本文運(yùn)用尿素法和SDS法自壇紫菜絲狀體和葉狀體提取DNA,用CTAB/NaCl溶液去除剩余的多糖,反復(fù)多次,能純化得到高質(zhì)量的DNA,經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè),OD260/OD280值為1.84~1.93之間,瓊脂糖凝膠電泳可知大小為23kb左右,可用于壇紫菜DNA質(zhì)粒文庫(kù)的構(gòu)建、酶切反應(yīng)和SSR-PCR擴(kuò)增?! ∮孟拗菩詢?nèi)切酶Sau3AI處理提取的絲狀體DNA后,選擇性回收300~900bp的片段,然后將這些小片段DNA連接至經(jīng)BamH
2、I酶切并經(jīng)細(xì)菌堿性磷酸酶(BAP)去磷酸化處理后的pUC18質(zhì)粒載體上,最后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(Escherichiacoli)JM109感受態(tài)細(xì)胞中,從而構(gòu)建了壇紫菜部分小片段DNA質(zhì)粒文庫(kù)。經(jīng)藍(lán)/白斑篩選,獲得384個(gè)白色克??;選用pUC18質(zhì)粒的通用引物(5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3',5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3')進(jìn)行PCR反應(yīng)來(lái)對(duì)這些陽(yáng)性克隆進(jìn)一步篩選并檢測(cè)插入片段的大小,其中278個(gè)含有大小合適
3、的插入片段。將含有300~900bp之間插入片段的克隆送交測(cè)序,并利用網(wǎng)絡(luò)在線軟件進(jìn)行序列分析,在壇紫菜中獲得172個(gè)微衛(wèi)星序列,分別分布于103個(gè)不同的陽(yáng)性克隆中。 在發(fā)現(xiàn)的微衛(wèi)星序列中選取了32條微衛(wèi)星序列設(shè)計(jì)了引物,然后進(jìn)行SSR-PCR擴(kuò)增。SSR-PCR優(yōu)化反應(yīng)體系為:0.4μM引物,200μMdNTPs,1.5mMMg2+,1UTaqDNA聚合酶,30ng左右模板DNA;優(yōu)化反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5min后進(jìn)入循環(huán)體系,
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