壇紫菜（Porphyra haitanensis）微衛(wèi)星序列的分離、特性及應用.pdf

1、本文運用尿素法和SDS法自壇紫菜絲狀體和葉狀體提取DNA，用CTAB/NaCl溶液去除剩余的多糖，反復多次，能純化得到高質(zhì)量的DNA，經(jīng)紫外分光光度計檢測，OD260/OD280值為1.84～1.93之間，瓊脂糖凝膠電泳可知大小為23kb左右，可用于壇紫菜DNA質(zhì)粒文庫的構(gòu)建、酶切反應和SSR-PCR擴增。　　用限制性內(nèi)切酶Sau3AI處理提取的絲狀體DNA后，選擇性回收300～900bp的片段，然后將這些小片段DNA連接至經(jīng)BamH

2、I酶切并經(jīng)細菌堿性磷酸酶(BAP)去磷酸化處理后的pUC18質(zhì)粒載體上，最后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(Escherichiacoli)JM109感受態(tài)細胞中，從而構(gòu)建了壇紫菜部分小片段DNA質(zhì)粒文庫。經(jīng)藍/白斑篩選，獲得384個白色克??；選用pUC18質(zhì)粒的通用引物(5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'，5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3')進行PCR反應來對這些陽性克隆進一步篩選并檢測插入片段的大小，其中278個含有大小合適

3、的插入片段。將含有300～900bp之間插入片段的克隆送交測序，并利用網(wǎng)絡在線軟件進行序列分析，在壇紫菜中獲得172個微衛(wèi)星序列，分別分布于103個不同的陽性克隆中?！　≡诎l(fā)現(xiàn)的微衛(wèi)星序列中選取了32條微衛(wèi)星序列設計了引物，然后進行SSR-PCR擴增。SSR-PCR優(yōu)化反應體系為：0.4μM引物，200μMdNTPs，1.5mMMg2+，1UTaqDNA聚合酶，30ng左右模板DNA；優(yōu)化反應程序：94℃預變性5min后進入循環(huán)體系，