ZIP激酶基因缺失在胃癌中的研究.pdf

1、胃癌是一種人類常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率位居腫瘤第四位。每年全球有70萬(wàn)人死于胃癌，胃癌是引起腫瘤相關(guān)死亡的第二大殺手。我國(guó)為胃癌高發(fā)地區(qū)，主要分布在西北和沿海地區(qū)。目前胃癌的治療效果不理想，5年生存率小于20％。主要原因是就診時(shí)已到晚期；胃癌細(xì)胞對(duì)現(xiàn)有的化療藥物不敏感。因此深入研究胃癌的病因及發(fā)病機(jī)制，對(duì)胃癌的預(yù)防與治療有著迫切與重要的價(jià)值。 越來(lái)越多學(xué)者認(rèn)為腫瘤是基因病，必須探明腫瘤發(fā)病的分子機(jī)制才能從根本上控制腫瘤的發(fā)

2、生和發(fā)展。胃癌的發(fā)生與發(fā)展與其它腫瘤一樣，是一個(gè)多因素作用、多基因參與、多階段發(fā)展的疾?。换蚪M不穩(wěn)定是其重要特征。基因組不穩(wěn)定在染色體水平表現(xiàn)染色體易位、擴(kuò)增和缺失等；在核酸水平表現(xiàn)為基因的突變、基因缺失和擴(kuò)增、微衛(wèi)星不穩(wěn)定、表觀遺傳異常引起的基因沉默?；蚪M不穩(wěn)定引起癌基因激活、抑癌基因失活以及凋亡相關(guān)基因失衡等；細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化和凋亡等過(guò)程的失調(diào)控。分子生物學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)研究進(jìn)一步證實(shí)胃癌的發(fā)生、演進(jìn)是多種基因突變累積的結(jié)果，

3、其中癌基因激活及抑癌基因失活發(fā)揮著關(guān)鍵作用。 基因擴(kuò)增(geneamplification)是原癌基因激活的主要方式。原癌基因的擴(kuò)增和過(guò)度表達(dá)為腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)提供選擇優(yōu)勢(shì)，促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生與演進(jìn)。基因缺失(geneloss)是抑癌基因失活的重要方式。抑癌基因的缺失喪失了該基因在細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖和細(xì)胞穩(wěn)定維持等多方面的調(diào)控功能，從而促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生。胃癌細(xì)胞系及胃癌組織中均存在著復(fù)雜的染色體改變，主要表現(xiàn)為腫瘤染色體特異部位的擴(kuò)增

4、和缺失，導(dǎo)致了癌基因激活及抑癌基因失活。因此染色體高頻擴(kuò)增區(qū)很可能存在癌基因并由于擴(kuò)增而激活；而頻繁出現(xiàn)基因等位缺失的染色體區(qū)域可能存在著腫瘤抑癌基因并失活。所以從篩選和定位染色體特異區(qū)域的擴(kuò)增和缺失入手，可以尋找、確定與胃癌相關(guān)的癌基因以及抑癌基因。 應(yīng)用CGH技術(shù)檢測(cè)不同發(fā)展階段的腫瘤染色體異常，不但可以了解腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子基礎(chǔ)，而且可為腫瘤的診斷和預(yù)后判斷提供遺傳標(biāo)志。更為重要的是以CGH發(fā)現(xiàn)的染色體異常區(qū)域?yàn)榛A(chǔ)，可在

5、擴(kuò)增或丟失的染色體區(qū)域中明確新的與腫瘤相關(guān)的癌基因或抑癌基因。我們課題組曾應(yīng)用CGH技術(shù)檢測(cè)了62例原發(fā)性胃癌染色體拷貝數(shù)的改變，結(jié)果顯示染色體高頻擴(kuò)增的區(qū)域是8q、20q、13q、和3q；高頻缺失區(qū)域位于19p、17p、1p。進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)19p缺失全部出現(xiàn)在印戒細(xì)胞癌中?；谝陨系慕Y(jié)果本研究應(yīng)用高分辨、高通量的比較基因組雜交微點(diǎn)陣(CGH-array)技術(shù)，設(shè)計(jì)獨(dú)特基因組DNA微點(diǎn)陣，包含650個(gè)人工細(xì)菌染色體克隆(BAC)，以精

6、確地定位胃癌腫瘤染色體異常的部位，挑選具有明確臨床病理意義的染色體異常區(qū)域，通過(guò)DNA熒光原位雜交(FISH)技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。用蛋白印跡技術(shù)(westernblot)、組織微點(diǎn)陣(TMA)和免疫組織化學(xué)技術(shù)(IHC)檢測(cè)相關(guān)基因的蛋白表達(dá)的變化，分析其臨床意義。 本文的目的在于篩選、定位與胃癌相關(guān)的癌基因的擴(kuò)增以及抑癌基因的缺失，結(jié)合相關(guān)基因的蛋白表達(dá)的變化，探討可能的致癌機(jī)制，為闡明胃癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。全文共分為四

7、個(gè)部分： 一、比較基因組雜交微點(diǎn)陣(CGH-array)技術(shù)檢測(cè)胃癌分子遺傳學(xué)改變收集30例新鮮胃癌組織，包括癌組織和癌旁正常胃粘膜組織。提取基因組DNA，用隨機(jī)引物PCR的方法擴(kuò)增樣本DNA和參考DNA，分別標(biāo)記Cy3和Cy5于上述PCR產(chǎn)物上，與微點(diǎn)陣BAC克隆DNA進(jìn)行雜交。用GenePix分析軟件分析Cy3:Cy5的比值，判斷染色體拷貝數(shù)的改變。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)：有28例樣本獲得滿意結(jié)果。胃癌組織中染色體DNA擴(kuò)增的頻

8、發(fā)區(qū)域依次出現(xiàn)于：16q21(53.6％)、19q13.1(42.9％)、5p15.4(32.1％)、3q26.3(28.6％)、3q21(25.0％)、13q14-13q21(25.0％)、13q21.1(25.0％)、3q13.3(21.4％)、19q13.1-13.2(21.4％)。缺失的頻發(fā)區(qū)域依次出現(xiàn)于：19q13.3(67.9％)、3q21(64.3％)、3p21(57.1％)、3p22(53.6％)、3p14(50.0％)

9、、13q21.33(39.3％)、5p15.3(35.7％)、16q24.3(35.7％)、19p13.3(35.7％)、13q31(28.6％)。10例出現(xiàn)19p13.3缺失，其中8例組織學(xué)類型為彌散型。該結(jié)果與我們以往研究一致，提示19p13.3可能包含著與胃癌發(fā)生有密切聯(lián)系的抑癌基因。 二、熒光原位雜交(FISH)驗(yàn)證胃癌組織中染色體19p13.3缺失收集49例胃癌組織的石蠟切片，根據(jù)前面的CGH-array和CGH的結(jié)果

10、，選取染色體19p13.3的BAC克隆RP11-75H6為探針。BACDNA以紅色熒光標(biāo)記，制備成熒光探針；在組織切片上進(jìn)行間期核FISH雜交，熒光顯微鏡下觀察，每50個(gè)細(xì)胞中低于1個(gè)紅色信號(hào)就認(rèn)為存在缺失。 結(jié)果如下：在49例胃癌樣本中有25例(51％)出現(xiàn)19p13.3的缺失。在32例組織學(xué)為彌散型胃癌中有17例存在19p13.3的缺失(53.1％)。而16例腸型胃癌中7例出現(xiàn)缺失(43.7％)。雖然差異沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)

11、，但我們看到19p13.3的缺失較易出現(xiàn)在彌散型中。胃癌中19p13.3的缺失是頻發(fā)事件，19p13.3的缺失與男性發(fā)病相關(guān)。該區(qū)可能存在某些抑癌基因與彌散型胃癌的組織學(xué)發(fā)生有內(nèi)在的聯(lián)系。BACRP11-75H6包含ZIP激酶基因該基因調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡和自噬，與細(xì)胞的死亡密切相關(guān)，篩選此基因作進(jìn)一步的研究。 三、蛋白印跡(WB)及免疫組化(ICH)檢測(cè)ZIP激酶蛋白在胃癌組織的表達(dá)收集新鮮胃癌組織27例，提取癌組織和癌旁正常組織蛋

12、白質(zhì)應(yīng)用westernblot檢測(cè)ZIPk的表達(dá)。 結(jié)果如下：27例癌旁組織均檢測(cè)到ZIPk蛋白的表達(dá)，腫瘤組織中有8例ZIPk蛋白表達(dá)減少，占29.6％。低分化腺癌中有5例，中分化腺癌中有2例，1例印戒細(xì)胞癌都出現(xiàn)明顯ZIPk表達(dá)減少。I期病例無(wú)ZIPk表達(dá)減少，II期有2例，IIIa期2例，IIIb期2例，IV期2例。晚期病例出現(xiàn)ZIPk表達(dá)減少的比例較中期高(44.4％：25％)，但統(tǒng)計(jì)學(xué)分析沒有性顯著差。 在胃癌

13、組織芯片上應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法，檢測(cè)ZIP激酶編碼的蛋白在胃癌中的表達(dá)情況，并分析ZIP激酶表達(dá)異常與臨床病理的聯(lián)系，同時(shí)探討ZIP激酶表達(dá)異常對(duì)胃癌病人預(yù)后的影響。結(jié)果如下： 應(yīng)用免疫組化檢測(cè)161例癌組織和80例癌旁胃粘膜組織ZIP激酶基因的表達(dá)。有78例癌旁胃粘膜組織存在較強(qiáng)胞漿內(nèi)ZIP激酶基因的表達(dá)(97.5％)。50例胃癌腫瘤組織中有高水平的表達(dá)(28.5％)，27例低表達(dá)(16.8％)，84例弱或不表達(dá)(52.2)％

14、。 分析臨床病理資料顯示ZIP激酶的低或不表達(dá)與組織學(xué)類型相關(guān)(p<0.007)，其中17例印戒細(xì)胞癌中未發(fā)現(xiàn)ZIP激酶的表達(dá)，與彌散型組織學(xué)類型相關(guān)(p=0.045)。ZIP激酶的低或不表達(dá)與腫瘤的浸潤(rùn)深度(p<0.001)、TMN分期(p<0.001)、腫瘤的轉(zhuǎn)移(p<0.001)密切相關(guān)。通過(guò)生存分析顯示正常ZIP激酶表達(dá)組5年生存率為62％，生存時(shí)間的中位數(shù)為71.5月。ZIP激酶低或不表達(dá)組5年生存率為37.8％，生存

15、時(shí)間的中位數(shù)為32.6月。Kaplan-Meier分析表明高表達(dá)組的總體生存時(shí)間和癌癥特異的生存時(shí)間均較低或不表達(dá)組長(zhǎng)。log-rank(COX-Mantel)檢驗(yàn)示差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.001)。在COX模型中，單因素分析ZIP激酶低或不表達(dá)是影響胃癌病人長(zhǎng)期生存的風(fēng)險(xiǎn)因素。在多因素分析中ZIP激酶的影響并不明顯，ZIP激酶并不是作為一個(gè)獨(dú)立因素影響胃癌病人的預(yù)后，而是通過(guò)影響腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移影響預(yù)后。 四、末端標(biāo)記技術(shù)

16、(TUNEL)檢測(cè)不同ZIP激酶表達(dá)組胃癌腫瘤細(xì)胞的凋亡56例胃癌樣本根據(jù)免疫組化結(jié)果分為ZIP激酶高表達(dá)組(28例)和不表達(dá)組(28例)，應(yīng)用末端標(biāo)記法顯示凋亡細(xì)胞。觀察500-1000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算凋亡指數(shù)均數(shù)。 結(jié)果如下：ZIP激酶高表達(dá)組凋亡指數(shù)均數(shù)5.8±0.38％，不表達(dá)組凋亡指數(shù)均數(shù)1.8±0.379，差異具有顯著性(p<0.001)。 根據(jù)上述結(jié)果，我們得出如下結(jié)論： 1.染色體16q21、19q1

17、3.1、5p15.4、3q26.3、3q21、13q14-13q21、13q21.1、3q13.3、19q13.1-13.2的擴(kuò)增以及19q13.3、3q21、3p21、3p22、3p14、13q21.33、5p15.3、16q24.3、19p13.3、13q3的缺失是胃癌發(fā)展過(guò)程中的頻發(fā)事件，提示這些區(qū)域可能存在癌基因的擴(kuò)增與抑癌基因的缺失，并與胃癌發(fā)生與發(fā)展相關(guān)。 2.胃癌中19p13.3的缺失是頻發(fā)事件，19p13.3的缺