丹參等活血化瘀中藥對(duì)IL-1β刺激的HSC的影響.pdf

1、目的：肝纖維化是各種慢性肝炎向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)階段，肝纖維化的病理基礎(chǔ)是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的過度沉積和異常分布。肝星狀細(xì)胞(HSC)活化、增殖是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)，它可以合成Ⅰ、Ⅲ型膠原、非膠原糖蛋白、蛋白多糖等構(gòu)成ECM的主要成分，同時(shí)也是參與ECM降解的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)、金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMPs)的主要細(xì)胞來源。MMPs對(duì)ECM有廣泛降解作用，TIMPs為MMPs特異性抑制因子，MMPs和TIMPs共同作用

2、，調(diào)節(jié)ECM動(dòng)態(tài)平衡。 IL-1為一種具有多種生物學(xué)功能的強(qiáng)有力的炎性細(xì)胞因子，可以通過刺激肝臟炎癥反應(yīng)啟動(dòng)和加速肝纖維化的發(fā)展，促進(jìn)人HSC膠原合成，誘導(dǎo)黏附因子及其受體表達(dá)，并促進(jìn)TGF-β、TIMP合成與分泌。IL-1的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要涉及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路和NF-κB通路。目前研究發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中MAPK家族包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)、c-jun氨基端激酶(JNK)、p38和ERK5。

3、ERK激活后移位至胞核激活核轉(zhuǎn)錄因子從而調(diào)控細(xì)胞增殖與分化。 隨著肝纖維化的發(fā)生機(jī)制逐漸闡明，肝纖維化治療成為可能。目前尚乏理想的抗纖維化西藥。中醫(yī)中藥治療慢性肝炎肝纖維化，療效顯著，且乏毒性，顯示出良好趨勢(shì)。為進(jìn)一步探討中藥的抗肝纖維化機(jī)制，本研究以體外培養(yǎng)的HSC為研究對(duì)象，研究丹參等活血化淤中藥對(duì)IL-1β刺激的HSC增殖、Ⅰ型膠原合成及MMP-13、TIMP-1基因表達(dá)、ERK信號(hào)蛋白的影響，探討“益肝康”抗纖維化機(jī)制，

4、為治療肝纖維化新藥研制開發(fā)提供理論依據(jù)。 方法：根據(jù)既往中藥浸膏制備流程制備中藥浸膏?；罨拇笫蟾涡菭罴?xì)胞(HSCs)株體外培養(yǎng)。 1.培養(yǎng)的HSC按以下分組接種于96孔板、24孔板或50mL培養(yǎng)瓶： A組空白對(duì)照組B組IL-1β10ng/mL干預(yù)組C組IL-1β10ng/mL+丹參2mg/mL干預(yù)組D組IL-1β10ng/mL+小復(fù)方2mg/mL干預(yù)組E組IL-1β10ng/mL+益肝康2mg/mL干預(yù)組F組丹

5、參2mg/ml干預(yù)組G組小復(fù)方2mg/m1干預(yù)組H組益肝康2mg/ml干預(yù)組活細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-CCK-8測(cè)定HSC增殖，3H-脯氨酸(3H-Pro)摻入法測(cè)定Ⅰ型膠原合成，RT-PCR測(cè)定MMP-13、TIMP-1基因表達(dá)。 2.培養(yǎng)的HSC接種于50mL培養(yǎng)瓶，分別于IL-1β預(yù)刺激5min、15min、30min、60min、120min時(shí)提取胞漿蛋白，Western印跡法檢測(cè)ERK信號(hào)蛋白的表達(dá)量。選取ERK表達(dá)量最高的時(shí)

6、間點(diǎn)，提前加入益肝康干預(yù)30min，再加IL-1β作用檢測(cè)ERK的表達(dá)量。 結(jié)論： 1.IL-1β可促進(jìn)HSCs增殖和Ⅰ型膠原合成，而丹參等活血化瘀中藥可抑制HSCs增殖和Ⅰ型膠原合成，并可抑制經(jīng)IL-1β預(yù)刺激后的HSCs增殖和Ⅰ型膠原合成，并且中藥復(fù)方“益肝康”的作用強(qiáng)于丹參和丹參小復(fù)方。 2.IL-1β能促進(jìn)MMP-13基因表達(dá)，加入活血化瘀中藥干預(yù)后MMP-13基因表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)，益肝康的作用最強(qiáng)；IL-

7、1β亦促進(jìn)TIMP-1基因表達(dá)，而丹參等活血化瘀中藥可抑制TIMP-1基因表達(dá)，并可抑制經(jīng)IL-1β預(yù)刺激后的TIMP-1基因表達(dá)，并且益肝康的作用強(qiáng)于丹參和丹參小復(fù)方。 3.IL-1β作用15minERK表達(dá)已開始增加，30分鐘達(dá)高峰，120分鐘已衰減到正常水平，說明IL-1β通過ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮作用。提前加入益肝康干預(yù)30min再加入IL-1β作用30min后ERK表達(dá)并未增加，推測(cè)益肝康可能阻斷ERK通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，