過氧化苯甲酰對HepG2細(xì)胞DNA損傷作用及其可能的毒性機(jī)制研究.pdf

1、目的:過氧化苯甲酰(benzoylperoxide，BPO)是我國自上世紀(jì)80年代以來普遍添加于面粉中的一種漂白劑，它具有增白面粉、加速面粉后熟、抑制面粉霉變、提高出粉率等作用。近年來，人們愈發(fā)關(guān)注它作為食品添加劑產(chǎn)生的安全隱患問題，使其應(yīng)用備受爭議。我國于2011年5月起禁止使用過氧化苯甲酰作為食品添加劑。而在世界范圍內(nèi)，仍有多個(gè)國家繼續(xù)使用過氧化苯甲酰作為食品添加劑，且添加量參差。
　　 目前有研究表明外用BPO作為治療痤瘡

2、的藥物成分存在致癌可能，但攝入BPO具體對人類健康存在哪些影響及危害，仍無定論。因有報(bào)道BPO加熱時(shí)可分解產(chǎn)生苯自由基，受此啟發(fā)，擬探討B(tài)PO產(chǎn)生的活性氧對HepG2細(xì)胞是否具有遺傳毒性，并進(jìn)一步研究其機(jī)制。我們選用的HepG2細(xì)胞是來源于人類的肝癌細(xì)胞系，它保留了人類正常肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的許多功能，有較完整的生物轉(zhuǎn)化代謝酶活性，被認(rèn)為是檢測外來化合物遺傳毒性的理想細(xì)胞系。
　　 本實(shí)驗(yàn)研究選用HepG2細(xì)胞，檢測BPO的遺傳毒性及其

3、氧化應(yīng)激及溶酶體、線粒體途徑的毒理學(xué)機(jī)制，旨在為攝入BPO引發(fā)的人類健康安全隱患提供試驗(yàn)及理論依據(jù)。
　　 方法:以HepG2細(xì)胞作為檢測系統(tǒng)。用單細(xì)胞凝膠電泳(SGCE)來檢測DNA鏈的斷裂，用蛋白質(zhì)印跡法(westernblot)來檢測損傷蛋白P53的生成。為了闡明BPO對HepG2細(xì)胞的遺傳毒性機(jī)制，用2'，7'一二氫二氯熒光素(DCFH)來測定細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平，通過N-乙酰半胱氨酸(NAC)干預(yù)試驗(yàn)減少ROS生

4、成來探討氧化性損傷氧化應(yīng)激在對DNA損傷中發(fā)揮的作用;分別以吖啶橙(AO)和羅丹明123（Rhodamine123）為探針來測定細(xì)胞內(nèi)溶酶體膜穩(wěn)定性和線粒體膜電位的改變水平，通過氯化銨(NH4Cl，溶酶體膜保護(hù)劑)、地昔帕明(desipramine，酸性神經(jīng)鞘磷脂酶的抑制劑)進(jìn)行干預(yù)來探討溶酶體膜穩(wěn)定性與DNA損傷的關(guān)系。此外，分別用NAC、NH4Cl和地西帕明干預(yù)單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)與蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)，以更好的驗(yàn)證試驗(yàn)機(jī)制。試驗(yàn)結(jié)果用SP

5、SSv11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　 結(jié)果:25-100μMBPO與HepG2細(xì)胞接觸1h后，細(xì)胞內(nèi)DNA鏈發(fā)生斷裂，熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞呈彗星樣拖尾，其尾長和尾DNA含量隨藥物濃度增加而明顯增加，呈劑量依賴效應(yīng)，用NAC、NH4Cl、地西帕明進(jìn)行干預(yù)后，尾長和尾DNA含量明顯減少。25-100μMBPO與HepG2細(xì)胞接觸24h后，檢測到P53表達(dá)明顯增多，呈劑量依賴效應(yīng)，用NAC、氯化銨、地西帕明干預(yù)后，P53表達(dá)明

6、顯減少。25-100μMBPO作用于HepG2細(xì)胞1h后，引起細(xì)胞內(nèi)ROS水平的增高，與對照組相比其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，用NAC干預(yù)后，ROS水平明顯下降。25-100μMBPO與HepG2細(xì)胞接觸1h后，溶酶體膜穩(wěn)定性下降，呈劑量依賴效應(yīng)，用NAC、氯化銨干預(yù)后，溶酶體膜穩(wěn)定性得到一定保護(hù)。25-100μMBPO與HepG2細(xì)胞反應(yīng)一小時(shí)，可使HepG2細(xì)胞線粒體膜電位下降，其差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:BPO(25-1

7、00μM)可以導(dǎo)致HepG2細(xì)胞DNA損傷，對HepG2細(xì)胞具有遺傳毒性。同時(shí)，研究還表明BPO(25-100μM)可以導(dǎo)致HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS水平增高，且用抗氧化劑NAC干預(yù)后ROS水平明顯降低，同時(shí)DNA鏈斷裂程度減弱，損傷蛋白P53表達(dá)減少，表明該DNA損傷可能與氧化應(yīng)激有關(guān)。BPO(25-100μM)可導(dǎo)致HepG2細(xì)胞內(nèi)溶酶體膜穩(wěn)定性降低，氯化銨與地西帕明的干預(yù)使HepG2細(xì)胞溶酶體膜穩(wěn)定性升高，且能減弱DNA鏈斷裂的程度，