蜂毒素下調(diào)HDAC2抑制HepG2增殖的作用及機(jī)制研究.pdf

1、腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多基因參與的過(guò)程,其一個(gè)重要起因是腫瘤細(xì)胞的異常增殖,而在細(xì)胞體內(nèi)存在組蛋白乙酰化和去乙?；g的動(dòng)態(tài)平衡,已有研究表明,兩者之間平衡的失調(diào)將導(dǎo)致某些特定基因表達(dá)異常,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖,進(jìn)而加速腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究顯示蜂毒素能夠抑制組蛋白去乙酰化酶,而蜂毒素是一種從蜂毒中提取的水溶性多肽,是其重要組成成分及活性成分,其具有抗腫瘤活性,但其具體的作用機(jī)制未明。為了進(jìn)一步探討蜂毒素的抗腫瘤作用機(jī)制,本文主要從體外觀察蜂毒素對(duì)

2、HepG2細(xì)胞增殖的影響,并探討其部分作用機(jī)制。研究?jī)?nèi)容由以下四個(gè)部分組成。
　　1.蜂毒素對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響。
　　實(shí)驗(yàn)以人肝細(xì)胞癌HepG2細(xì)胞為研究對(duì)象,分為陰性對(duì)照組,蜂毒素組(1,4 and8μg/ml)和陽(yáng)性對(duì)照組(TSA)。MTT法檢測(cè)蜂毒素對(duì)HepG2細(xì)胞活力的影響,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)蜂毒素對(duì)細(xì)胞周期的影響,及Western blot和RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞周期因子CyclinD1和CDK4的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3、表明,蜂毒素對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖具有抑制作用,并呈濃度依賴性,同時(shí)周期G0/G1期細(xì)胞數(shù)隨濃度上升,而S期細(xì)胞數(shù)則逐漸減少。蜂毒素對(duì)細(xì)胞增殖的抑制阻止在細(xì)胞周期的G1/S期,并且細(xì)胞周期因子CyclinD1和CDK4的表達(dá)逐漸降低。由此說(shuō)明,蜂毒素具有抑制HepG2細(xì)胞增殖的作用。
　　2.蜂毒素恢復(fù)PTEN的表達(dá)及降低其下游Akt的磷酸化水平。
　　實(shí)驗(yàn)分組同上。Real-time PCR方法檢測(cè)PTEN的mRNA的表達(dá)

4、,Western blot檢測(cè)PTEN、p-Akt蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與陰性對(duì)照組比較,蜂毒素上調(diào)PTEN的表達(dá),同時(shí)降低了磷酸化Akt的表達(dá)。由此說(shuō)明,蜂毒素抑制細(xì)胞增殖的作用可能與其上調(diào)了PTEN的表達(dá)有關(guān)。
　　3.HDAC2參與調(diào)控PTEN表達(dá)的機(jī)制研究。
　　1)HDAC2 siRNA沉默:根據(jù)HDAC2設(shè)計(jì)并合成siRNA,通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到HepG2細(xì)胞內(nèi),實(shí)驗(yàn)分為陰性對(duì)照組,Scramble siRNA組

5、和HDAC2 siRNA組。RT-PCR檢測(cè)HDAC2和PTEN的mRNA的表達(dá),Western blot檢測(cè)HDAC2、ac-H3、PTEN和p-Akt的蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與陰性對(duì)照組比較,靶向沉默HDAC2后PTEN的表達(dá)顯著上調(diào),降低磷酸化Akt的表達(dá),并促進(jìn)組蛋白H3的乙酰化,而Scramble siRNA組各基因的表達(dá)無(wú)顯著差異。
　　2)HDAC2重組質(zhì)粒的過(guò)表達(dá):實(shí)驗(yàn)分為陰性對(duì)照組、空載體組、HDAC2質(zhì)粒組

6、。Real-time PCR方法檢測(cè)PTEN mRNA的表達(dá),Western blot檢測(cè)PTEN、p-Akt和ac-H3蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與陰性對(duì)照組比較,HDAC2過(guò)表達(dá)后PTEN的表達(dá)顯著下降,磷酸化的Akt的表達(dá)增高,并抑制組蛋白H3的乙?；?而空載體組各基因的表達(dá)無(wú)顯著差異。上述結(jié)果表明HDAC2參與了PTEN基因表達(dá)的調(diào)控。
　　4.蜂毒素對(duì)HDAC2的調(diào)控作用研究:實(shí)驗(yàn)分為陰性對(duì)照組,蜂毒素組(1,4 and