內皮素-1及其受體、受體拮抗劑在肺動脈高壓綜合征肉雞中的作用研究.pdf

1、肉雞肺動脈高壓綜合征(pulmonaryhypertensionsyndrome，PHS)亦稱肉雞腹水綜合征(ascitessyndrome，AS)，又稱“心衰綜合征”(heartfailuresyndrome，HFS)等，是快速生長肉雞的一種常見非傳染性疾病，以明顯的腹水和心、肺功能衰竭為特征。全世界養(yǎng)雞業(yè)每年因此病而損失巨大，隨著養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展，該病的發(fā)生有逐漸上升之勢。肺動脈壓升高是肉雞肺動脈高壓綜合征的重要特點并對它的形成起決定性

2、作用。內皮素(endothelin-1，ET-1)是一種由內皮細胞合成和分泌的、具有強烈收縮血管作用和促進細胞增生的血管活性多肽，心鈉素(atrialnatriureticpeptide，ANP)、血管緊張素H(angiotensinⅡ，AH)、NO等在心血管系統(tǒng)功能的調節(jié)中也起著重要作用。為研究肉雞PHS的發(fā)病機理，本試驗主要從ET-1角度出發(fā)，從以下幾個方面對本試驗進行了研究：用高能日糧飼喂較多肉雞的方法獲得PHS肉雞模型；用放射免

3、疫分析方法比較了不同腹水程度肉雞在不同日齡時血漿和主要組織中ET-1的含量，同時還用硝酸還原酶法和放射免疫法對NO、NOS、ANP、AⅡ在肉雞PHS發(fā)病過程中的作用加以研究；通過免疫組織化學染色方法和RT-PCR的方法研究了ETA受體及其基因在不同腹水程度和不同日齡肉雞體內的分布情況及其表達水平；通過短期靜脈注射ET-1、內皮素受體拮抗劑BQ123和長期給予ET-1的方法研究了ET-1、BQ123對肉雞肺動脈壓、PHS發(fā)病率、主要組織病

4、理變化以及一些生理生化指標的影響；同時利用細胞培養(yǎng)的方法研究了ET-1、BQ123、L-Arg、L-NAME對培養(yǎng)的肉雞心肌細胞的作用，從而比較全面地從ET-1的角度研究了肉雞PHS的發(fā)病機理。主要試驗結果如下： (1)用高能日糧飼養(yǎng)肉雞時從10日齡起有PHS發(fā)生，發(fā)病率為5.3％-6.7％，與自然情況下的發(fā)病率基本相同；右心導管法研究發(fā)現(xiàn)2-6周齡時肺動脈高壓(PH)組肉雞的平均肺動脈壓(mPAP)極顯著(p＜0.01)高于正

5、常組肉雞；腹水心臟指數(shù)(ascitesheartindex，AHI)也極顯著(p＜0.01)或顯著(p＜0.05)高于正常組，且隨日齡的增長有上升的趨勢；PH組肉雞血漿和主要組織(心、肝、肺、腎)中ET-1在2-5周齡時也顯著(p＜0.01)或極顯著(p＜0.05)高于正常組，而在6周齡時則呈現(xiàn)出復雜的變化；血漿ANP、NO、AⅡ在2-5周齡時顯著或極顯著高于正常組，隨日齡的增長有升高的趨勢，而在6周齡時則呈現(xiàn)出不規(guī)則的變化；幾種組織相

6、比，肺臟ET-1的含量最高；mPAP與血漿ET-1相關性顯著，與血漿NO沒有相關性，血漿ET-1與NO也沒有明顯的相關性。 (2)用免疫組織化學染色的方法和RT-PCR的方法對不同腹水程度、不同日齡肉雞ETAR及其基因在體內定位及其表達變化的情況進行了探討。免疫組織化學染色的研究結果表明，ETAR在肉雞主要組織如心臟中的心肌細胞膜、心包膜和血管平滑肌，肝臟中的肝細胞膜和枯否氏細胞，肺臟中的大小血管、次級支氣管、三級支氣管和肺泡，

7、腎臟的近遠曲小管、腎小球、致密斑、髓袢、腎血管均有不同程度的表達；與正常組相比較，PH組、輕度腹水組、重度腹水組肉雞肺臟各級血管以及肺泡ETAR的表達均比正常組顯著或極顯著升高，但隨著腹水程度的加深，ETAR的表達量反而降低，其中PH組ETAR的表達量最高；隨腹水程度的加深，心臟ETAR的表達量顯著或極顯著降低，但仍顯著或極顯著高于正常組，右心室心肌中ETAR的表達量明顯高于左心室心肌；PH組和輕度腹水組肉雞肝細胞ETAR的表達量比正常

8、組和重度腹水組均高，而肝血管中腹水組同正常組相比較其表達量極顯著降低；腎小管、腎血管、腎小球和致密斑中ETAR的表達隨腹水程度的加深也呈現(xiàn)出復雜的變化；對于不同日齡的正常肉雞，內皮素A型受體基因mRNA在心臟組織中的表達量在16日齡時明顯低于30日齡時的表達量，而對于同一日齡(30d)的肉雞，發(fā)生重度腹水的肉雞內皮素A型受體基因mRNA的表達量明顯要低于正常肉雞。 (3)2-6周齡不同腹水程度(正常組、輕度腹水組、重度腹水組)肉

9、雞之間相比較，mPAP、AHI以及血漿ET-1、ANP、NO均隨腹水程度的加深而顯著(p＜0.05)或極顯著(p＜0.01)升高，且隨日齡的增長而呈升高趨勢，而全心/體重比(TV/Bw)隨日齡的增長卻呈下降趨勢；不同腹水程度肉雞血漿iNOS和cNOS隨腹水程度的加深而呈現(xiàn)出復雜的變化；用放射免疫分析的方法對5周齡不同腹水程度的肉雞主要組織中ET-1、ANP的研究發(fā)現(xiàn)，5周齡時主要組織中的ET-1、ANP均隨腹水程度的加深其含量顯著(p＜

10、0.05)或極顯著(p＜0.01)增加，且肺臟和心臟的含量明顯高于其它組織中的含量；肺組織中iNOS、cNOS的含量呈現(xiàn)出比較復雜變化趨勢，iNOS隨腹水程度的加深和日齡的增長而呈升高趨勢，而cNOS則隨腹水程度的加深呈降低趨勢；不同腹水程度肉雞之間AHI與mPAP以及血漿ANP、ET-1與AHI、mPAP之間存在正相關性，5周齡時mPAP、AHI與心臟ET-1含量之間也存著正相關性，而血清NO含量與血漿ET-1、ANP、心臟ET-1含

11、量之間無明顯的相關性。 (4)對28日齡肉雞分組并從翼靜脈注射不同劑量的ET-1、BQ123以及ET-1和BQ123聯(lián)合應用，并以注射生理鹽水組為對照組，對mPAP進行檢測，同時還檢測了不同時間血漿AⅡ、ANP、ET-1的變化。研究發(fā)現(xiàn)，當靜脈注射24、120、240ng/kg的ET-1后，高劑量的ET-1可引起血壓雙向性升高，即先瞬時下降然后呈劑量依賴性升高，內皮素的有效升壓劑量為240ng/kg；靜脈注射0.5、1、3μg/

12、kg的BQ123能使mPAP呈劑量依賴性下降，且能完全拮抗1×10-8mol/L的ET-1引起的血壓升高效應，但不能拮抗ET-1引起的初始血壓下降現(xiàn)象；另外在注射ET-1或BQ123后對不同時間血漿ET-1、ANP、AⅡ也有明顯的影響。從15日齡開始將170只肉雞分為3組，對照組50只注射生理鹽水，另兩組各60只分別注射240、360ng/kg的ET-1，發(fā)現(xiàn)ET-1呈劑量依賴性地提高了肉雞PHS的發(fā)病率，并且使試驗組肉雞的紅細胞壓積(

13、PCV)、mPAP、AHI、血漿NO不同程度地升高，且隨日齡的增長而呈現(xiàn)出增加趨勢；組織切片顯示當長期注射外源性的ET-1后肉雞主要組織如心、肝、肺、腎均發(fā)生了不同程度的病理學變化。 (5)用酶消化法對肉雞心肌細胞進行培養(yǎng)，并用免疫化學染色方法對肉雞心肌細胞進行了鑒定，試驗采用第3至5代的心肌細胞進行試驗。用MTT法以及3H-TdR、3H-Pro、3H-Leu滲入法研究發(fā)現(xiàn)，當ET-1的濃度≥1×10-8mol/L時，ET-1對

14、心肌細胞有明顯的促生長和促肥大作用，ET-1濃度越高，則其促心肌細胞生長作用越強，1×10-8mol/L的BQ123則可完全拮抗ET-1對心肌細胞的作用，且BQ123濃度越高，則抑制作用越明顯，而單獨加入不同濃度的BQ123也發(fā)現(xiàn)BQ123呈劑量依賴性抑制心肌細胞的增殖；用熒光標記法研究發(fā)現(xiàn)，ET-1可呈劑量依賴性地促進心肌細胞內[Ca2+]i內流，BQ123則可拮抗ET-1這種作用，但不能拮抗ET-1初期對心肌細胞[Ca2+]i瞬時增