強(qiáng)優(yōu)勢(shì)玉米雜交種豫玉22雌穗均一化cDNA文庫(kù)的構(gòu)建與鑒定.pdf

1、本文通過(guò)TrizolReagent分離了強(qiáng)優(yōu)勢(shì)玉米雜交種豫玉22關(guān)鍵發(fā)育時(shí)期—雌穗分化時(shí)期—的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，構(gòu)建了均一化cDNA文庫(kù)，為進(jìn)一步研究和分離與雜種優(yōu)勢(shì)相關(guān)的基因構(gòu)建了技術(shù)平臺(tái)。在雌穗分化期中分別構(gòu)建四個(gè)獨(dú)立cDNA文庫(kù)，所提取總RNA紫外分光光度計(jì)測(cè)得OD260/OD280的比值為1.87、1.86、1.85和1.99，電泳檢測(cè)顯示18S、28SrRNA條帶清晰，且28S亮度明顯大于18S。分別以Not1pr

2、imer-adapter為引物合成cDNA第一條鏈，隨后以鏈置換法合成cDNA雙鏈。經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)：兩條鏈最長(zhǎng)可達(dá)5kb。在雙鏈cDNA兩段加接頭，經(jīng)過(guò)NotⅠ酶切，cDNA的分級(jí)分離，與載體NotⅠ-SalⅠ-Cutvector連接，轉(zhuǎn)化生成四個(gè)獨(dú)立cDNA文庫(kù)，重組率分別為：90％、87％、85％和93％，克隆數(shù)目分別為：2.7×105、6.4×104、3.1×105和2.1×104，每個(gè)獨(dú)立庫(kù)隨機(jī)挑取200個(gè)克隆，PCR

3、檢測(cè)插入片斷長(zhǎng)度平均為1.2kb、1.3kb、1.4kb和1.3kb?！　≡ビ?2基因組DNA分別用EcoRⅠ、BamHⅠ先后酶切，單酶切后用KlenowFragment和C-21-biotin-dUTP補(bǔ)平末端，固定在鏈霉親和素磁珠上，構(gòu)建成基因組DNA親和雜交體系，而后取兩份均勻混合的體系先預(yù)雜交，接著四個(gè)獨(dú)立cDNA文庫(kù)各取10ug加入進(jìn)行雜交。結(jié)束后，洗脫下雜交上的部分，復(fù)性轉(zhuǎn)化生成3×104個(gè)克隆的均一化cDNA文庫(kù)。挑取其