鯉均一化全長(zhǎng)cDNA文庫構(gòu)建、大規(guī)模測(cè)序及信息學(xué)分析.pdf

1、鯉魚(Cyprinus carpio),原產(chǎn)于歐亞大陸,是世界上重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類。為進(jìn)一步分析研究鯉魚轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及其功能基因,我們構(gòu)建了鯉均一化全長(zhǎng)cDNA文庫。本研究以1齡雌性鯉魚的八種組織為材料,包括血液、鰓、卵巢、肝胰臟、頭腎、體腎、心和腦組織,利用Cap-trapper法,制備成全長(zhǎng)Uncut cDNA原始文庫。對(duì)原始文庫進(jìn)行檢測(cè),文庫總克隆數(shù)(CFU)為6.4×106,重組率大于95％。采用基因組DNA飽和雜交原理,對(duì)文庫進(jìn)

2、行均一化處理,從而構(gòu)建了鯉魚均一化的全長(zhǎng)cDNA文庫,CFU為2×105,重組率大于95％,插入片段平均長(zhǎng)度大于1.0kb,全長(zhǎng)比例大于90％。qPCR檢測(cè)表明,文庫均一化后,β-actin豐度相對(duì)于均一化前降低了87倍。
　　對(duì)均一化后的文庫隨機(jī)挑取43008個(gè)克隆,利用M13F(-20)通用引物進(jìn)行5’端測(cè)序,成功測(cè)序并得到29779條序列。序列處理后聚類拼接,獲得15116條非重復(fù)序列(unigene),并提交至NCBI數(shù)據(jù)

3、庫。對(duì)得到的unigene進(jìn)行長(zhǎng)度分布及GC含量分析,序列長(zhǎng)度主要分布在300bp-700bp間,平均長(zhǎng)度為540bp;GC含量分析表明鯉魚基因cDNA序列中GC含量為45.53％。基于本地Linux平臺(tái),使用BLASTX與無冗余蛋白數(shù)據(jù)庫(NR)進(jìn)行比對(duì)分析,對(duì)8437條序列進(jìn)行了注釋,包括分子功能、生物學(xué)過程和細(xì)胞組分三個(gè)層次,其中細(xì)胞組分分為13個(gè)部分,分子功能分為12個(gè)部分,生物學(xué)過程分為22個(gè)部分。
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