牛外周血單個(gè)核細(xì)胞酵母雙雜交cDNA文庫(kù)的構(gòu)建和鑒定.pdf

1、布氏桿菌病(Brucellosis）是一種人畜共患傳染病。19世紀(jì)末期被人們發(fā)現(xiàn)并廣泛研究，迄今為止已經(jīng)有100多年的歷史。布氏桿菌病是我國(guó)規(guī)定的乙類動(dòng)物疫病，也是目前嚴(yán)重威脅養(yǎng)牛業(yè)發(fā)展和人類健康的重要疾病之一。酵母雙雜交系統(tǒng)是用來(lái)研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與小分子之間相互作用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。是通過建立牛外周血單個(gè)核細(xì)胞的cDNA文庫(kù),來(lái)篩選與牛布氏桿菌結(jié)合的受體蛋白,對(duì)布氏桿菌病的預(yù)防和控制有重要的意義。
　　本研究預(yù)先制備牛外周血

2、單個(gè)核細(xì)胞,采用Trizol法提取牛外周血單個(gè)核細(xì)胞的總RNA。利用美國(guó)Clontech公司的SMART技術(shù)構(gòu)建牛外周血單個(gè)核細(xì)胞的酵母雙雜交cDNA文庫(kù)。將全部的DNA合成cDNA的前端，然后在整個(gè)反應(yīng)中加入SMART III Oligo,目的是讓cDNA的前端與mRNA形成互補(bǔ)，合成雙鏈cDNA的方法是通過長(zhǎng)距離PCR(LD-PCR)。因?yàn)殡p鏈cDNA與PGADT7-Rec利用酵母細(xì)胞內(nèi)具有非常相似的重組酶活性,進(jìn)而形成具有復(fù)制活性

3、的文庫(kù)質(zhì)粒,那么在SD/-Leu培養(yǎng)板上篩選出所有克隆。所以用純化后的雙鏈cDNA與線性化質(zhì)粒PGADT7-Rec連接,轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞Y187感受態(tài)中,并用PEG/LiAc的方法完成轉(zhuǎn)化。再次通過稀釋的方法計(jì)算轉(zhuǎn)化率與文庫(kù)的容量大小，然后通過菌落PCR的方法檢查重組率和插入片段的大小。
　　結(jié)果顯示，提取的牛外周血單個(gè)核細(xì)胞的總 RNA濃度為1050ng/ul，OD260/OD280為1.95,后經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分析可見28S和