梭子蟹乳化病的病原及診斷技術(shù)的研究.pdf

1、梭子蟹(Portunus trituberculatus)隸屬于甲殼綱(Crustacea)、十足目(Decapoda)、梭子蟹科(Portunidae)、梭子蟹屬（Portunus），是浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖主要品種之一。為了進(jìn)一步搞清養(yǎng)殖梭子蟹乳化病的病原及其致病機(jī)理，找到有效的防治方法，本文以典型癥狀的病蟹作為材料，通過(guò)菌株的分離鑒定、人工感染試驗(yàn)、病理組織觀察等手段，對(duì)梭子蟹乳化病的病原進(jìn)行了研究，并且采用血液生理生化指標(biāo)、ELIS

2、A 、免疫熒光和UPPCR-SSCP等技術(shù)對(duì)梭子蟹乳化病進(jìn)行診斷，以期為梭子蟹乳化病的早期診斷及防治提供科學(xué)依據(jù)。 2002～2004年在浙江省寧波、舟山等地養(yǎng)殖場(chǎng)，從瀕死的梭子蟹體內(nèi)分離到兩株菌分別為1205－11和1205－21。通過(guò)菌體形態(tài)、培養(yǎng)特性和生理生化反應(yīng)，鑒定這兩株菌分別為溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）和葡萄牙假絲酵母(Candida lusitaniae)。人工感染證實(shí)：這兩株菌是梭子蟹乳

3、化病的病原菌，溶藻弧菌是主要病原菌，葡萄牙假絲酵母為繼發(fā)性感染，蟹體的損傷部位是傳播的主要途徑。 對(duì)患乳化病的梭子蟹進(jìn)行了血液生化指標(biāo)檢測(cè)。結(jié)果表明，與健康梭子蟹相比：肌酐、總膽固醇、鈉、氯、鎂和鈣等指標(biāo)明顯上升，而血糖、總蛋白、白蛋白、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、乳酸脫氫酶、堿性磷酸酶等指標(biāo)卻顯著下降。通過(guò)人工感染試驗(yàn)的追蹤檢測(cè)，并與對(duì)照組相比，感染后24h發(fā)生明顯變化的血液生化指標(biāo)為血糖、總膽固醇、總蛋白、谷草轉(zhuǎn)氨酶和鎂，此五種

4、指標(biāo)可作為梭子蟹乳化病的早期診斷指標(biāo)。 以梭子蟹乳化病的病原菌――溶藻弧菌為抗原，制成免疫血清，利用辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗兔血清（HRP-IgG）為酶標(biāo)二抗，建立了檢測(cè)溶藻弧菌的間接ELISA快速診斷法。結(jié)果表明，應(yīng)用間接ELISA技術(shù)檢測(cè)溶藻弧菌有較高的靈敏度，最低的檢測(cè)量為1×104cfu/mL。同時(shí)交叉反應(yīng)表明其具有較高的特異性。人工感染48h后，就能在血淋巴和鰓中檢測(cè)到溶藻弧菌。應(yīng)用建立的間接ELISA法進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，表

5、觀有病蟹的陽(yáng)性檢出率為90﹪，表觀健康蟹的陽(yáng)性檢出率為20﹪，養(yǎng)殖海水中沒(méi)有陽(yáng)性檢出。 以梭子蟹乳化病的病原菌――溶藻弧菌為抗原，制血兔抗血清，利用異硫氰酸熒光素標(biāo)記的羊抗兔血清建立了梭子蟹乳化病的間接熒光抗體快速診斷法。結(jié)果表明，應(yīng)用間接熒光抗體技術(shù)檢測(cè)溶藻弧菌有較高的靈敏度，最低的檢測(cè)量為1×105cfu/mL。同時(shí)交叉反應(yīng)表明其具有較高的特異性。人工感染試驗(yàn)24h后，就能在鰓和血淋巴中檢測(cè)到溶藻弧菌。應(yīng)用建立的間接熒光抗體

6、技術(shù)進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，表觀有病蟹的陽(yáng)性檢出率為90﹪以上，表觀健康蟹的陽(yáng)性率檢出率為20﹪，養(yǎng)殖海水中沒(méi)有陽(yáng)性檢出，與ELISA檢測(cè)結(jié)果大致相同。 采用通用引物PCR配合SSCP分析即UPPCR-SSCP技術(shù)，研究快速檢測(cè)梭子蟹乳化病病原菌的分子生物學(xué)診斷技術(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用通用引物，溶藻弧菌可以和嗜水氣單胞菌、銅綠假單胞菌、創(chuàng)傷弧菌、河流弧菌等部分常見(jiàn)水產(chǎn)病原菌區(qū)分開(kāi)來(lái)，這樣可以建立一種針對(duì)于梭子蟹乳化病致病菌的UPPCR-PCR