三疣梭子蟹Toll樣受體基因的克隆及表達分析.pdf

1、目前，各種病害的頻發(fā)已經成為制約我國三疣梭子蟹養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的重要因素。因此，對三疣梭子蟹免疫系統(tǒng)的研究將有助于在疾病的防治、預防、品種選育及三疣梭子蟹免疫抗病機理等領域的研究和闡明具有重要意義和價值。
　　Toll樣受體是一種重要的模式識別受體，在脊椎動物以及無脊椎動物先天性抗感染免疫中發(fā)揮重要作用。本研究采用同源克隆和RACE技術首次從三疣梭子蟹鰓組織中獲得 Pt-Toll的cDNA全長，并利用半定量及實時熒光定量PCR技術對

2、 Pt-Toll在各組織中的分布及表達水平進行了分析；同時在不同溫度(18℃、30℃)、鹽度(16‰、32‰)條件下，以及在溶藻弧菌、假絲酵母菌、WSSV和LPS的免疫刺激下，利用實時熒光定量 PCR方法檢測 Pt-Toll在三疣梭子蟹鰓組織和血淋巴中 mRNA水平的表達變化；體外構建 Pt-Toll胞外結構域序列原核表達載體 pEASY?-E1-Pt Toll，并在大腸桿菌 BL21(DE3)中表達該蛋白；利用大量原核表達的外源蛋白乳

3、化制備抗原，免疫注射小鼠并獲得抗血清，蛋白免疫印跡顯示所得到的抗血清能夠與抗原發(fā)生特異性結合。實驗主要研究成果如下：
　　1.同源克隆和RACE技術獲得三疣梭子蟹 Toll樣受體基因 cDNA序列全長，同源性分析表明，Pt-Toll與擬穴青蟹 SpToll、中華絨螯蟹 EsToll1的同源性最高，其次為凡納濱對蝦 LvToll2等蝦類，與黑腹果蠅 DmToll等物種的親緣關系相對較遠。三疣梭子蟹 Toll樣受體具典型的TLR跨膜蛋

4、白結構：富含13個亮氨酸重復序列的胞外區(qū)、跨膜區(qū)、含典型 TIR結構域的胞內區(qū)。
　　2.半定量和實時熒光定量 PCR結果發(fā)現(xiàn)，Pt-Toll基因在三疣梭子蟹的鰓、心臟、肌肉、血淋巴、腸道5個組織中都有表達，其中鰓組織中的表達量最高，步足肌和心臟中表達量相對較低。
　　3.實時熒光定量 PCR結果顯示，Pt-Toll在不同溫度(18℃、30℃)脅迫條件下鰓組織中的表達水平無顯著差異；在不同鹽度(16‰、32‰)脅迫條件下鰓組

5、織中 Pt-Toll的相對表達水平也無顯著性差異，說明三疣梭子蟹 Pt-Toll對溫度和鹽度的脅迫刺激不敏感。
　　4.實時熒光定量 PCR結果顯示，Pt-Toll在溶藻弧菌、假絲酵母菌、WSSV和LPS的免疫刺激下，僅 WSSV試驗組在鰓組織中的表達水平差異不明顯，其他各組在鰓組織和血淋巴中的表達水平均表現(xiàn)顯著或極顯著上調，推測 Pt-Toll可能參與三疣梭子蟹抗感染免疫過程。
　　5.成功構建 pEASY?-E1-Pt