小麥抗葉銹基因Lr35成株抗性的差異表達研究.pdf

1、小麥抗葉銹基因Lr35最初來源于斯卑爾脫小麥(Triticum speltoides),通過與T.monococcum的二倍體回交將其轉(zhuǎn)移到小麥品種馬奎斯(Marquis)中,位于2B染色體上,該基因與Sr39緊密連鎖,其抗性在二葉期開始表達,六葉期后完全表達,是一個應(yīng)用潛力很大的抗病基因.因此開展Lr35成株抗性基因的表達研究對于了解小麥的抗病機制、克隆抗病基因、合理利用該基因均具有重要的意義.該研究借助于cDNA-AFLP技術(shù),以T

2、hatcher為感病對照,研究小麥抗葉銹基因Lr35不同葉期,接菌后不同時間內(nèi)的基因表達差異.獲得如下結(jié)果:1.建立了一套適合于小麥cDNA研究的cDNA-AFLP分析的最優(yōu)化體系及反應(yīng)程序.通過以小麥cDNA為模板,對AFLP選擴反應(yīng)體系進行摸索和優(yōu)化試驗.本研究所用AFLP選擴反應(yīng)體系為:20μL的反應(yīng)體系中含有5μL模板cDNA,2μL10×PCRbuffer,10mMdNTP0.4μL,0.6UTaqDNA聚合酶,20mM引物.

3、反應(yīng)程序:第一個循環(huán)是將小麥cDNA 94℃預(yù)變性2min;接著94℃變性30s,65℃退火30s(每個循環(huán)降-0.7℃),72℃延伸1min,循環(huán)12次;然后94℃變性30s,56℃退火30s,72℃延伸1min,循環(huán)23次;最后一個循環(huán)完成后,再72℃延伸2min.2.應(yīng)用96對AFLP引物對小麥抗葉銹基因Lr35的不同葉期及接種后不同時間的樣品進行篩選,獲得到6對能擴增出Lr35不同葉期與對照樣品之間的差異表達量或差異表達條帶的A

4、FLP引物,分別是E-TG/M-CTC,E-TG/M-CAG,E-TG/M-CAC,E-TC/M-CAT,E-TG/M-CTG和E-TC/M-CAA,共得到68條差異表達的條帶.3.研究發(fā)現(xiàn)小麥抗葉銹基因Lr35的差異表達方式分兩種:一種表達方式是基因表達量的差異,主要是引物組合E-TC/M-CAT在260bp、195bp和190bp處擴增出Lr35樣品中基因的表達量隨接種時間的延長而增加,而在感病對照Thatcher中沒有出現(xiàn)表達量的

5、增加.另一種表達方式是出現(xiàn)特異性條帶,引物組合包括E-TG/M-CTC,E-TG/M-CAG,E-TG/M-CAC,E-TG/M-CTG和E-TC/M-CAA.特別是引物組合E-TG/M-CTG可以從小麥抗葉銹基因Lr35的二葉期到六葉期的樣品中擴增出一條195bp左右的特異性條帶,而在感病對照Thatcher、Lr35苗期樣品和未接種的對照Lr35中缺失這條195bp的條帶.該條帶在Lr35二葉期樣品接種后60h開始表達,三葉期樣品4

6、8h開始表達,四葉期樣品接種后48h開始表達,五葉期樣品接種36h后開始表達,六葉期樣品接種后36h開始表達,初步說明該條帶為Lr35受葉銹菌誘導(dǎo)表達的特異性條帶.4.將所得到的68條差異表達的條帶回收擴增,回擴出33條差異條帶,回擴效率為49％.將回擴得到的33個差異條帶樣品進行反向Northern blot驗證,共得到7個有顯著差異的片段.其中引物E-TG/M-CTG中得到的差異條帶經(jīng)反向Northernblot,證明為小麥抗葉銹基