核桃花粉管通道法基因轉(zhuǎn)化效率因子的研究.pdf

1、本研究以清香核桃種胚為試材，對(duì)離體胚培養(yǎng)進(jìn)行研究，以提高胚的萌發(fā)成苗率和繼代增殖效果；以遼寧5號(hào)繼代苗和清香種胚為試材，研究潮霉素和卡那霉素對(duì)核桃繼代苗生長(zhǎng)和種胚萌發(fā)的影響，進(jìn)行適宜選擇壓的篩選，為今后核桃遺傳轉(zhuǎn)化研究打下良好的基礎(chǔ)；以核桃品種中林1號(hào)、綠波、晉龍、清香等為試材，采用花粉管通道法將外源基因?qū)牒颂抑?，?duì)外源DNA濃度、導(dǎo)入時(shí)間、導(dǎo)入方法等因素進(jìn)行系統(tǒng)研究，為進(jìn)一步提高花粉管通道法進(jìn)行核桃遺傳轉(zhuǎn)化的效率奠定基礎(chǔ)；
　

2、　 主要結(jié)果如下：
　　 1.核桃離體胚培養(yǎng)：胚萌發(fā)階段以DKW培養(yǎng)基+6-BA0.5～1.0mg/L+IBA 0.01mg/L+白砂糖45～55g/L有利于胚萌發(fā)，不定芽分化多，增殖效果最好。種胚萌發(fā)后頂芽和兩側(cè)的不定芽以6-BA1.0～1.5mg/L配合IBA 0.03mg/L有利于胚培苗增殖擴(kuò)繁。
　　 2.核桃繼代苗和種胚對(duì)抗生素的敏感性測(cè)定：遼寧5號(hào)核桃繼代苗在含Hyg18mg/L的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，植株明顯褐化

3、死亡，在含Kan300mg/L的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)受抑制，全部白化；清香核桃種胚在Hyg20mg/L時(shí)種胚褐化，在Kan150mg/L種胚無(wú)分化，呈短縮的白色錐體狀。
　　 3.制作熒光切片觀察授粉后花粉的萌發(fā)和伸長(zhǎng)情況。外源DNA溶液的滴加時(shí)間宜在授粉后14～48h，此時(shí)花粉管通道已經(jīng)打開，有利于DNA的導(dǎo)入；子房注射的時(shí)間宜在授粉后24～48h，此時(shí)花粉管到達(dá)胚囊。
　　 4.利用花粉管通道法將農(nóng)桿菌AGL1的質(zhì)粒DNA導(dǎo)

4、入四個(gè)核桃主栽品種中，結(jié)果表明：不同導(dǎo)入方法在受體當(dāng)代結(jié)實(shí)率上存在較明顯的差異，其中子房注射法結(jié)實(shí)率低于滴加法，達(dá)到顯著水平。導(dǎo)入方法宜采用切割柱頭滴加法，既能保證坐果率，又有利于外源DNA溶液導(dǎo)入胚囊。
　　 5.外源DNA濃度為200μg/mL和500μg/mL時(shí)結(jié)實(shí)率和果實(shí)子葉GUS基因瞬時(shí)表達(dá)率較高，濃度增加結(jié)實(shí)率和GUS基因瞬時(shí)表達(dá)率降低。
　　 6.轉(zhuǎn)化果實(shí)胚培養(yǎng)成苗后經(jīng)Hyg15mg/L的繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行抗