11830.基于比較基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的枯草芽孢桿菌過(guò)量積累核黃素遺傳機(jī)理研究

1、基于比較基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的枯草芽比較基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的枯草芽孢桿菌桿菌過(guò)量積累過(guò)量積累核黃素核黃素遺傳遺傳機(jī)理機(jī)理研究研究InsightsintogeicacteristicsofriboflavinoverproducingBacillussubtilisbasedoncomparativegenomicstranomics國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（973計(jì)劃）：2011CBA00804；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目：NSFC2120

2、6112；國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）：2012AA022103；一級(jí)學(xué)科：化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)科專(zhuān)業(yè)：生物化工研究生：王光路指導(dǎo)教師：趙學(xué)明教授天津大學(xué)化工學(xué)院二零一四年十月中文摘要中文摘要本課題選取核黃素合成基礎(chǔ)菌株為研究對(duì)象，通過(guò)比較基因組與比較轉(zhuǎn)錄組分析，篩選出潛在正向突變，進(jìn)一步利用無(wú)痕等位基因置換技術(shù)，逆向代謝工程重構(gòu)突變菌株，考察不同突變對(duì)于核黃素合成貢獻(xiàn)度。對(duì)鑒定的正向突變進(jìn)行機(jī)理分析，闡述導(dǎo)致枯草芽孢桿菌過(guò)量合成核

3、黃素的遺傳機(jī)制。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表明，和對(duì)照菌株相比，B.subtilis24pMX45菌株共有945個(gè)差異表達(dá)基因，表達(dá)水平上調(diào)的基因有483個(gè)，表達(dá)水平下調(diào)的基因有462個(gè)。進(jìn)一步數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，B.subtilis24pMX45核黃素合成途徑表達(dá)水平較高，但嘌呤代謝途徑、一碳單位代謝相關(guān)途徑表達(dá)水平低。同時(shí)，中心碳代謝途徑和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)基因表達(dá)水平較低，這些可能是該菌葡萄糖利用速率低、生長(zhǎng)速度慢和核黃素合成速率較低的原因。結(jié)合全基因組突

4、變分析與比較轉(zhuǎn)錄組結(jié)果，通過(guò)無(wú)痕等位基因置換技術(shù)，鑒定出7個(gè)正向突變：RibC（G199D）、ribD（G39A）、PurA（P242L）、CcpN（A44S）、YvrH（R222Q）、YhcF（R90）、YwaA（Q68）。將正向突變以及游離質(zhì)粒pMX45重構(gòu)至工程菌株BSW54pMX45，可達(dá)到B.subtilis24pMX45菌株80%的核黃素合成水平。其中，RibC（G199D）、ribD（G39A）顯著解調(diào)了核黃素操縱子的表達(dá)

5、。PurA（P242L）導(dǎo)致了腺苷琥珀酸合成酶活性喪失，導(dǎo)致IMP向AMP合成受阻，菌體過(guò)量合成GMPGDPGTP，提高了核黃素合成前體物的供給水平。CcpN（A44S）喪失部分抑制活性，解調(diào)了糖異生代謝途徑，提升了戊糖磷酸途徑的通量和前體物核酮糖5磷酸的供給。雙組分系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子基因YvrH（R222Q）突變顯著提升核黃素合成能力。RTPCR實(shí)驗(yàn)表明，受其負(fù)調(diào)控lytABC的表達(dá)水平明顯上調(diào)，說(shuō)明YvrH（R222Q）部分丟失功能。轉(zhuǎn)

6、錄組數(shù)據(jù)表明，LytC（NacetylmuramoylLalanineaase）過(guò)表達(dá)導(dǎo)致菌株嘌呤合成途徑顯著增強(qiáng)，提高了核黃素合成能力，推測(cè)LytC的過(guò)表達(dá)改變了細(xì)胞壁完整性和滲透性，并進(jìn)一步解調(diào)了嘌呤合成途徑。在谷氨酸棒桿菌工程菌株△4PPC中過(guò)表達(dá)NacetylmuramoylLalanineaase可顯著提高5氨基乙酰丙酸合成能力，說(shuō)明這種作用機(jī)制對(duì)于提高生物基產(chǎn)品的產(chǎn)量可能具有一定普遍適用性。關(guān)鍵詞：關(guān)鍵詞：枯草芽孢桿菌；核黃